實驗材料 家兔胰核糖核酸酶 小球菌核酸酶 I 型磷酸肌酸激酶
試劑、試劑盒 乙酰苯肼溶液 A 溶液 B 滅菌重蒸水 CaCl2 EGTA 氯高鐵血紅素儲存液 亞精胺 磷酸肌酸 氨基酸 DTT HEPES 水 KCl 乙酸鎂 [35S] 甲硫氨酸.
儀器、耗材 電泳裝置干酪包布離心機
實驗步驟
一、材料與設備
(一）兔網織紅細胞裂解液的制備
1)2?3 kg 的家兔 6 只。
2)1.2% 乙酰苯肼，用 1moL/LHEPES(pH7.0) 中和至 PH7.5。
3) 溶液 A:140 mmol/LNaCL,l.5 mmol/L 乙酸鎂，5 mmol/LKCL,0.001% 肝素
4) 溶液 B:140 mmol/LNaCl,1.5 mmol/L 乙酸鎂，5 mmol/LKC1
5) 滅菌重蒸水
6)lOOmmol/LCaCl2
7)200 mmol/LEGTA(pH7.0)
8) 小球菌核酸酶（150000 單位/ml), 保存于坫氨酸濃度為 50 mmol/L(pH9.2)，CaCl2 濃度為 5 mmol/L 的溶液屮
9)I 型磷酸肌酸激酶 40n^/ml，保存 50% 甘油中）
10) 氯高鐵血紅素儲存液溶于乙二醇，濃度為 5 mg/ml), 氯卨鐵血紅素可按下法制備：在 400ul0.2mol/LKOH 中溶解氯高鐵血紅素（分子質暈為 652Da)，分多次緩慢添加，每次添加少量且各次之間應振蕩；加入水 600ul, 加入 lmol/LTris-Cl(pH7.8),100ul, 滴加 0.1mol/LHC1 調節 pH 至 7.8; 加入 4.8 ml 乙二醇，振蕩混合；4°C 以 5000 g 離心除去不溶性沉淀；用 lOmmol/LKCl 按 1:100 的比例稀釋氯高鐵血紅素，讀取 540nm 波長下的吸光度，推算其濃度（1 mmol/L 氯高鐵血紅素溶液吸光值為 11:1); 用比例為 4:1 的乙二醇：水溶液將氯高鐵血紅素的濃度調節至 5 mg/ml
11) 干酪包布。
12) 離心機。
(二）網織紅細胞裂解液的翻譯
1) 翻譯反應混合液：按 K 法配制翻譯反應混合液，分裝為 50?100ul/小份，儲存于一 70℃ 或液氮中。
100 mmmol/L 亞精胺 200ul
800 mmol/L 磷酸肌酸 400ul
5 mmoi/L 氨基酸 (不合甲硫氨酸） 200ul
lmol/LDTT 80ul
500 mmol/LHEPES(pH7.4) 1600ul
水 720ul
5 mm0l/L 氨基酸是含冇除甲硫氨酸外的所有氨基酸的溶液，濃度為 5 mmol/L。以 [35S] 甲硫氨酸對體外合成的蛋白質進行放射性標記時可使用這一溶液；如果以其他放射性標記氨基酸來標記蛋白質，則要使用相應的作標記氨基酸混合液。
2)lmol/LKCl
3)16.5 mmol/L 乙酸鎂
4)T5S] 甲硫氨酸.8O uCi 100?1200Ci/mmol/L，翻譯級
5) 胰核糖核酸酶，l00 ug/ml 溶于 50 mmol/LEDTA(pH8.O)
6) 電泳裝置。
二、操作方法
(一）兔網織紅細胞裂解液的制備
1）挑選體重 2?3 kg 的家兔 6 只，按以卜的程序皮下洼射乙酰苯肼溶液，以獲得貧血家兔的血液。
第一天注射 2.0 ml
第二天注射 1.6 ml
第三大注射 1.2 ml
第四天注射 1.6 ml
第五天注射 2.0 ml
2) 在第七和第八天按以下方法采血：先用酒精棉球擦拭家兔耳朵，然后用一新刀片在耳長屮段的耳中靜脈做一切口，每只家兔可采集 50 ml 血液，收集于 50 ml 冷卻的溶液A 中。在第七和第八大取血量府適量，第九天可用戊巴比妥或芬太尼（fcntanyl) 麻醉動物
后作心臟穿刺放血（約吋采集 150 ml 血液，收集于 100 ml 溶液 A 中）
3) 干酪包布過濾血液，然后于 4℃ 以 2000 尺離心 5 min, 吸出由密度不均一的內細胞形成的寬沉積帶的淡黃色的 H 細胞表層，用溶液 B 洗滌沉積的網織紅細胞和紅細胞 3 次，最后一次用 5000 g 進行離心。
4) 測量沉積細胞的體積，與等體積的預冷火菌雙蒸水混合，于 0℃ 進行裂解，Imin 后再于 4℃ 以 20000 g 將裂解液離心 20 min。
5) 在 100 份的網織紅細胞裂解液中加入 1 份氯高鐵血紅素和 2 份 CaCl2 溶液，混勻。
6) 加入 0.05 份小球繭核酸酶（150000 單位/ml)，混合后于 20℃ 溫育 15 min, 然后置于冰水浴中冷卻。
7) 加入 1 份 200 mmol/L 的 EGTA(pH7.0)，混句
8) 加入 0.4 汾磷酸肌酸激酶 (4 Gmg/ml), 混勻，把經過處理的細胞裂解液分裝為 250?500ul/小份, 保存于一 70℃ 或液氮中，
(二）網織紅細胞裂解液的翻譯
1)RNA 或 mRNA 按前面章節所述方法可獲得
2) 標準翻譯反應系統組成如下：
翻澤反應混合液 2ul
1mol/LKCl 2ul
16.5 mmol/L 乙酸鎂 1ul
[32S] 甲硫氨酸 8ul
小球菌核酸酶處理的網織紅細胞裂解液 10ul
RNA 2ul
于 30℃ 溫育 1 h。
3) 體外翻譯反應產物 PT 通過免疫沉淀和 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。
4) 進行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳時，在現有的樣品中加入 0.2 體積的胰核糖核酸酶，于-37℃ 溫育 15 mm 以水解 [35S] 甲硫氨酸-tRNA。之后立即加入 2XSDS 凝膠加樣緩沖液. 并煮沸樣品，加樣電泳。
5) 翻譯反應產物中未使用的部分保存于-20℃
注意事項
1) 網織紅細胞裂解液的翻譯活件取決于所加入的外源 mRNA。小球菌核酸酶在鈣離子存在時有活性，加入 EGTA 后其消化活性喪失。因此，要確保網織紅細胞裂解液中內源 mRNA 消化完全，以免翻譯時產生雜帶從而影響結果。
2) 氯高鐵血紅素是起始因子 cIF-2 抑制物的強阯遏劑，若缺少氯高鐵血紅素，網織紅細胞裂解液經短時間溫育后蛋白質合成就會停止。因此應在 20?80umol/L 范圍內對 K進行滴定，以取得最佳翻譯條件。
3) 溫和融化網織紅細胞裂解液，未用完的裂解液盡快放回一 70℃ 或液氮中。
4) 翻譯反應中乙酸鎂的濃度依網織紅細胞裂解液和 mRNA 的不同而小應在 0?1 mmol/L 的濃度范圍內對乙酸鎂進行滴定，然耵選用最佳濃度的乙酸鎂來確定不同濃度的氯化鉀（20?8OmmoI/L) 對特定目的 mRNA 的影響。一般來說，大約 70mol/L 的 KC1 最適于帶帽 mRNA 的翻譯；而對于非帶帽 mRNA, 其最適濃度是 40 mmol/L 左右。
5) 在反應系統中可加入多達 10ug 的總細胞質 RNA 或者 0.2ug 的 poly(A)+mRNA 或體外合成 RNA 至達到飽和。時使用poly(A)+mRNA 所得結果的背景要比使用細胞質 RNA 更小些
6) 在翻譯系統中加入飽和量的 mRNA 可剌激 [35S] 甲硫氨酸在可用酸沉淀的物質屮的摻入量的增加，可增加到 10?25 倍。在最佳條件下，25u1 反應混合物中約吋摻入 3X106?5X106 計數/min(l?3uCi) 的 [35S] 甲硫氧酸
7) 使用 10% 三氯乙酸（TCA) 沉淀放射忤標記蛋白前，應用 0.3moI/LNaOH 于 37°C 溫育 15 min 或 5%?10%TCA 在 100℃ 加熱 15 min，以此處理反應液以破壞 [35S] 甲硫氨酸-tRNA。用 TCA 沉淀少量蛋白質后，可測出蛋白質屮 [35S] 甲硫氨酸的摻入量
8) 用 SDS 聚閃烯酰胺凝膠電泳分析網織紅細胞裂解液時可能出現背景條帶。時常出現的那些按表觀分子質量為 45kDa 進行遷移的多肽得到 放射性標記，這一現象以及珠蛋白被標記的現象通常都是由硫氨酸中的雜質所引起的。對此問題，使用新購的放射性標甲硫氨酸一般可以避免
9) 雙鏈 DNA 模板在體外轉錄時常產生一定量的雙鏈 RNA, 它將抑制在網織紅細胞中進行的翻澤。如果翻洋效率不高，則應盡量減少體外轉錄中雙鏈 RNA 的量，同時將已知在網織紅細胞中有活性的對照 RNA4 不同屢的體外轉錄系統中產牛的 RNA 相混合，
進行翻譯試驗。