實驗步驟
一、用于細胞內注射的加帽 mRNA 的制備
材料
步驟
1.依次加入下列物質，終體積為 20ul，冰上操作：
2.37℃ 溫育 lh。
3.加入 Iul DNA 酶 I(無 RNA 酶)，37℃ 溫育 10 min。
4.用 RNaid 試劑盒提純 mRNA。
5.25ul 滅菌水（無 RNA 酶）溶解 RNA。
二、注射的準備
材料
溶液
(未提到的溶液，可以參見方法 1「培養神經元的原位雜交」相關部分)
步驟
1.從中樞神經系統分離神經元，保持其一長段軸突的完整。
2.在條件培養基中培養 i8~48 h, 直到從原有的軸突長出足夠的突起。
3.用鋒利的玻璃電極，從距離胞體大約一個細胞直徑的部位橫切軸突。
4.用微量加樣器給玻璃電極充灌 mRNA(質量濃度 2 〇?50ng/pd)。僅使電極頭部充滿 mRNA 溶液（每個電極大約用 0.3ul)。
5.穿刺軸突，以 20psi、持續 1~15S 脈沖將 mRNA 注射入軸突。在相差顯微鏡下可觀察到白色小滴狀的 mRNA。
6.溫育。溫育時間根據細胞類型和所用 mRNA 種類而定。在我們的實驗中，應用椎實螺屬編碼卵生激素前體的 mRNA,—般注射后溫育 2 h 可以檢測到其轉化的蛋白。
7.固定并透膜處理細胞，按培養神經元:ISH 方法中第 1-3 步進行。
8.TBSGT 洗滌 2 次，每次 5 min。
9.與一抗溫育、室溫 2 h 或 4℃ 過夜。
10.TBSGT 洗滌 2 次，每次 10 min。
11.與二抗溫育，室溫 1~2 h。我們的實驗應用 FITC 交聯的二抗，也可用酶交聯抗體。用堿性磷酸酶交聯二抗的步驟可參見方法 i「培養神經元的原位雜交’
12.TBSGT 緩沖液洗滌丄次，5 min.
13.水洗滌 2 次，每次 I0 min。
14.75% 甘油（溶于水）封片，甘油溶液中含 0.5% 乙二胺，以減慢 FITC 的褪色。
15.倒置熒光顯微鏡觀察。
三、結果
為研究離體軸突中的 mRNA 是否能轉化成蛋白質，我們將編碼卵生激素（ELH) 前體的 mRNA 注入 PedalA 細胞的軸突。我們首先證實這些細胞不表達 ELH 基因。然后通過免疫細胞化學方法用 ELH 的抗血清檢測注射 mRNA 的翻譯。結果顯示，離體軸突能夠將注射的 mRNA 轉化成通過免疫細胞化學方法可檢測到的蛋白質。轉化產物主要定位于生長錐和曲張體（圖 3-7)。