miRNA功能分析的五點建議

　　隨著microRNA(miRNA)研究的深入，很多人開始從miRNA的發現轉入功能分析。miRNA抑制是一種確定miRNA功能的強大技術。如何開展，需要注意些什么?Exiqon公司的專家給出了五點建議。

　　1. 選擇合適的抑制劑

　　若希望miRNA功能分析成功，首先要選擇一個最適合您實驗的抑制劑。

　　? 檢查您的目的miRNA是否屬于可能的功能冗余的miRNA家族。如果這些家族成員在您的系統中表達，則您應當考慮抑制整個家族的家族抑制劑。

　　? 如果您正在研究非常高表達的miRNA或難轉染的細胞，那么您應當考慮一些強力的抑制劑，如Exiqon的Power inhibitors。由于高穩定性，這些抑制劑適合需要長時間抑制的實驗。

　　? 如果您正在研究一些容易轉染的細胞，或不太能忍受強力抑制劑的細胞(如來自肌肉或中樞神經系統的細胞)，那么常規的抑制劑可能是更好的選擇。

　　　2. 優化您的轉染

　　優化轉染效率對提高miRNA抑制并降低副作用很關鍵。隨著細胞類型和所使用的轉染試劑不同，轉染效率也會變化。當然，最佳的轉染試劑和轉染條件必須根據經驗確定。如何優化?這里也許有您需要的答案(http://www.ebiotrade.com/newsf/2012-3/2012328173444787.htm)。

　　3. 開發一個分析來監控miRNA活性

　　在嘗試分析抑制miRNA活性的后果之前，您需要確定oligo的轉染已經實現了高效的miRNA抑制。因此，您需要開發一個分析，來監控miRNA的活性。通過功能分析，監控蛋白水平。或者，利用一個質粒，在報告基因(如螢光素酶)的3’ UTR插入miRNA靶點。不要使用miRNA qPCR!它容易產生假陽性結果。

　　4. 確定適當的量和開展表型分析的適當時間

　　所有寡核苷酸都是細胞毒性的，在高濃度時可能產生副作用。開展劑量反應研究，確定有效抑制miRNA時所需的最低濃度oligo。以此濃度來研究miRNA抑制的后果。記住，miRNA的功能可能只在有限的時間內是必需的。因此必須摸索轉染的時間和表型觀察的時間。實驗過程應總是帶有陰性對照，以評估轉染的非特異影響。

　　5. 了解您的研究

　　充分了解通路和關鍵蛋白對解釋miRNA抑制的表型結果很關鍵。Exiqon提供一個miRNA靶點預測工具，可列出大部分miRNA的數百個可能靶點。然而，挑戰在于如何縮小這個范圍。目前有一些生物信息學工具，可幫助您解釋miRNA目標列表。一旦您創建了這個短的列表，您可以驗證基因表達是否被miRNA抑制所去阻遏，從而確認這些候選靶點。下一個問題是這些靶點的去阻遏是否與觀察到的表型相關。解決此問題的一種方法是通過LNA? 反義oligo屏蔽miRNA靶點，防止miRNA與特定mRNA的相互作用，而不是抑制miRNA。這是一個好辦法，可評估哪個miRNA靶點才是觀察到表型的主要貢獻者。