圖1。上圖描述的是TaqMan miRNA的檢測原理,基于TaqMan實時定量miRNA的包括兩個步驟,莖環RT和實時PCR。莖環RT引物結合在miRNA分子的3'端和用反轉錄酶逆轉錄。然后,RT產品使用傳統的TaqMan PCR定量,其中包括特定miRNA的正向引物,反向引物和染料標記的TaqMan探針。尾正向引物5'的作用是根據miRNA分子的序列組成增加其熔融溫度(Tm)。


圖2。TaqMan-4 miRNA的檢測的動態范圍和靈敏度。 (A)4超過7個數量級的 lin-4 miRNA擴增曲線。合成的RNA輸入范圍從1.3×10-3 fM(相當于每次反應7個拷貝數) ?1.3×104 FM(相當于每次反應7×107拷貝數);(B)lin-4 miRNA的標準曲線。
miRNA定量的動態范圍和靈敏度的計劃使用一種人工合成的CEL-LIN-4靶進行首次評估。合成的RNA在 A26值的基礎上量化,稀釋超過7個數量級。 CEL-LIN-4 TaqMan miRNA的檢測結果顯示在目標輸入和CT值之間有極好的線性關系,表明,該檢測有至少7個動態范圍,并能夠檢測PCR反應中少于7個的拷貝數(圖2)。
采用小鼠肺總RNA的八個額外miRNA的檢測也被證實。RNA的輸入范圍從0.025到250納克(圖3)。 相關的RNA輸入的TheCT 值超過4個數量級(R2>0.994)。陰性對照檢測中,即使在250納克總RNA鼠標的反應中,CEL-MIR-2沒有給出一個檢測信號。
根據七個不同的鼠組織中五個miRNA的表達譜測定,創建一個miRNA的表達圖譜。每個細胞中的拷貝數根據輸入的總RNA(假設15皮克/細胞)和合成lin-4目標的標準曲線計算。從這個表達圖譜上作了一些有趣的觀察。首先,miRNA非常豐富,組織中每個細胞平均有2390個拷貝數。每個細胞表達的拷貝數在10-32090之間變化。在所有組織中,12個miRNA里,miR-16和miR-323是最豐富和最低量表達的miRNA。此外,每個組織都有獨特的miRNA的表達水平。miRNA表達的整體水平在小鼠肺中最高和胚胎中最低。最后,在7個組織中,miRNA表達的動態范圍變化很大,從不到5倍(let-7a)到超過2000倍(miR-323) (表1)。