microRNA的實時定量莖環RTPCR技術（四）

 圖5。對熱處理細胞，細胞裂解液和10 miRNA實時定量總RNA進行比較。用閾值循環（CT）來衡量miRNA的表達水平。每PCR擴增約400 HepG2細胞進行了分析。

圖6。的TaqMan miRNAmiR-16的分析比較來解決以印跡雜交為基礎的分析。總RNA來自小鼠腎，肝，肺，脾和睪丸組織。

由兩個獨立運行系統（數據未顯示）對12 miRNA16重復檢測TaqMan miRNA的可再現性。CT的標準偏差平均為0.1，顯示檢測的高精度。

我們采用一個獨立的技術，這個技術是基于雜交印跡的miRNA分析，比較TaqMan miRNA的檢測（圖6）。我們觀察到雜交為基礎的miRNA分析重復性差，在從目標到目標的變化中和TaqMan分析一致。五個鼠組織樣本中的miR-16的兩種方法（R2= 0.916）一致。然而，在低豐度的miRNA中相關性相對較低，如miR-30的（R2= 0.751）。

雜交的方法對成熟的miRNA來講缺乏特異性。我們調查了TaqMan miRNA區分成熟miRNA和較長的前體的檢測能力，合成pri-miRNA前體，pri-miR-26b和pri-let-7a和pre-miRNA 前體pre-miR-30a（見表2）。 TaqMan分析旨在檢測前體和成熟的miRNA進行合成平均1.5的目標×108％RT反應副本（每PCR體系1.3×10⁷拷貝數）。僅PRI-miRNA前體分子的TaqMan miRNA的分析產生了較成熟的miRNA的分析高出至少11個循環的CT值。這一結果意味著，如果成熟的miRNA和前體在濃度相同，后者將在檢測成熟的目標時貢獻<0.05％的背景信號。對于pre-miR-30a來講，成熟的miRNA miR-30a-3p定位于在pre-miR-30a序列3’末端，觀察到8.4 C_T的差異。結果表明，對于成熟miRNA來說，TaqMan miRNA的檢測是特異的。然而，如果miRNA位于pre-miRNA前體鏈5'端，特異性分析更好。總RNA實驗分析代替合成目標，表明，前體與成熟miRNA相比，至少豐富度小于兩個數量級，基于C^T 在miR-26b-1 和 let-7a-2前體的差異多于7個或7個以上數量級。一并考慮，這些結果表明，對于成熟miRNA來說，TaqMan miRNA的檢測更加特異。

 圖7。let-7 miRNA的檢測鑒別力。相對檢測（％）計算是基于C_T完全匹配和不匹配的目標之間的差異。在RT反應中添加合成RNA的1.5×10⁸ 拷貝數。估計濃度在A₂₆₀ 值的基礎上。