行使功能的microRNA成熟形式一般僅18——25nt，因此在逆轉錄環節通過特定引物增加其長度，以便于qPCR過程正常進行。
頸環法中的逆轉錄引物由自身可形成頸環結構的通用序列加上目的microRNA 3’端堿基的反向互補序列；
polyA加尾法即在逆轉錄前先加polyA尾，然后通過oligo(dT)引物進行逆轉錄。
方法設計及實驗成本均高于加尾法，但在檢測靈敏度及特異性方面具有優勢。
