實驗方法原理 與 rRNA, 5SRNA, 5.8 SRNA 和 tRNA 相比，大多數真核生物的 mRNA 在其 3' 端帶有 poly(A) 尾巴。因此，mRNA 能用 oligo(dT)-纖維素親和層析法從細胞總 RNA 中分離 (Edmonds et al. 1971; Aviv and Leder 1972)。
實驗材料 總 RNA
試劑、試劑盒 裝柱緩沖液洗脫緩沖液乙醇NaClNaOH乙酸鈉
儀器、耗材 Sorvall SS-34 轉子或相當的轉子杯子巴氏滴管貯存 RNA 設備oligo (dT)-纖維素pH 試紙水浴
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
2X 裝柱緩沖液（40 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6)，1 rnmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.2% (m/V)月桂基肌氨酸鈉）
洗脫緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，0.05% SDS）
乙醇
NaCl ( 5 mol/L), 無 RNA 酶
NaOH ( 10 mol/L)
乙酸鈉（3 mol/L, pH 5.2)
2. 核苷酸和寡聚核苷酸
總 RNA
3. 離心機和轉子
Sorvall SS-34 轉子或相當的轉子
4. 專用設備
測量 260 nm 吸光度的杯子
Dispocolumn ( Bio-Rad) 或塞以無菌玻璃毛的巴氏滴管
貯存 RNA 設備
oligo (dT)-纖維素
pH 試紙（pH 測試條，Sigma )
預設水浴至 65℃
二、方法
裝柱與填柱
1. 取 oligo (dT) —纖維素 0.5~1.0 g, 用 0.1 mol/L NaOH 重懸。
2. 用 oligo (dT) —纖維素（0.5~1.0 ml 柱體積）灌注 DEPC 處理過的一次性柱子（或塞以無菌玻璃毛的巴氏滴管，300℃ 烘烤滅菌 4 h)。用 3 倍柱體積 DEPC 處理過的水洗滌柱子。
3. 用無菌的 1X 裝柱緩沖液（用無菌的 DEPC 處理過的水稀釋 2X 的貯存液）洗滌柱子，直到流出液的 pH 值 < 8.0。用 pH 試紙測試。
4. 用雙蒸滅菌的水溶解 RNA，65℃，5 min 處理溶液。將溶液快速冷卻到室溫，并加入 1 倍體積的 2X 裝柱緩沖液。
柱上 poly (A)+ 的恢復
5. 將 RNA 溶液加到柱上，并立即用無菌的管子收集流出液。當所有的 RNA 溶液進入柱子時，用 1 倍體積的 1X 裝柱緩沖液洗柱，繼續收集流出液。
6. 當所有的液體流出柱子后，65℃ 加熱收集液 5 min, 重新加到柱子中。再次收集流出液。
7. 用 5~10 倍柱體積的 1X 的裝柱緩沖液洗滌柱子，用無菌塑料管（如微量離心管）收集 1 ml 洗滌液
8. 按 1:20 比例稀釋各部分收集液，用石英杯或處理過的異丁烯杯測量 260 nm 處的吸光值，以 1X 的裝柱緩沖液作為空白對照。
9. 將包含大多數 OD260 物質的部分用 2.5 倍體積的乙醇沉淀。
從柱中洗脫 poly(A)+ RNA
10. 用 2~3 倍柱體積的無菌、無 RNA 酶的洗脫緩沖液從 oligo (dT)-纖維素柱上洗脫 poly (A)' RNA。收集相當于 1/2~1/3 柱體積的流出液。
11. 用石英杯或處理過的異丁烯杯測量各部分收集液在 260 nm 處的吸光值。混合包含洗脫 RNA 的部分。
RNA 的進一步純化（可選）
經過一輪 oligo(dT)—纖維素柱的層析得到的物質通常會包含大約相同數量的多聚腺苷酸和不含多聚腺苷酸的 RNA, 可以按下面的步驟進一步純化。
12. 為進一步純化 poly(A)+RNA，65℃ 加熱準備的 RNA 3 min, 然后迅速冷卻到室溫。用 5 mol/L NaCl 調整洗脫的 RNA 中的 NaCl 濃度至 0.5 mol/L，在同一個 oligo (dT) —纖維素柱上進行第二輪層析（重復步驟 3 和 5~11)。
13. 對于第二輪 oligo (dT) —纖維素柱層析洗脫下來的 poly (A)+ RNA, 加入 3 mol/L 的乙酸鈉（pH 5.2) 至終濃度 0.3 mol/L。混合均勻。加入 2.5 倍體積冰冷的乙醇，混合，將該溶液置于冰上至少 30 min。
14. 在 10000 g（相當于 Sorvall SS-34 轉子 9000 r/min), 4℃ 下離心 15 min。小心棄掉上清，用 70% 乙醇洗滌沉淀（通常是不可見的）。稍做離心，吸出上清，將敞口的管子倒置幾分鐘，使大部分剩余酒精蒸發。不要使沉淀干燥。
15. 重新將潮濕的 RNA 沉淀用小體積的無菌、DEPC 處理過的水溶解。用石英杯或處理過的異丁烯杯測量每一部分柱子收集液在 260 nm 處的吸光值。將含有 RNA 的部分混合。
16. 保存制備好的 poly（A）+ RNA。