pcr的技術的主要步驟及pcr引物設計的一般原則

PCR的技術的主要步驟及PCR引物設計的一般原則分述如下：

PCR的技術的主要步驟：

1、DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

2、引物設計的基本原則

1、引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

3、引物內部不應出現互補序列。

4、兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

5、引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。

6、引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。

7、引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。