qPCR的原理

　　這一期關注點在qPCR的原理上，我會將每一環節拆開掰碎展示給大家。

　　 上期講過，要對樣本中的靶標進行定量，就要將靶標的數量和一定的信號反饋建立聯系。這一點比較容易理解，比如我們要對一種熒光物質定量，那么一定范圍內熒光信號的強度（吸光度）就與物質的數量成正比；對某種底物定量，那么在酶濃度一定且過量的情況下，一定范圍內底物濃度與催化初始速率成正比。對靶標的定量也要從這個方向努力，比如上期介紹過的QuantitativeCompetitive PCR（QC-PCR）就是這樣的設計。

　　 qPCR也是要從這里入手，它的出現得益于DNA聚合酶5’核酸外切酶活性的發現[1]和熒光檢測設備（CCD）的問世。核酸外切酶活性可以將鏈延伸的過程中碰到的雜交探針給水解掉，從將熒光分子釋放下來發出熒光信號。探針是參與qPCR反應的重要元件[2]，它是一條能與擴增區段雜交的寡核苷酸單鏈（Fig.1）。其5’端標記了特定的熒光基團Reporter，比如常見的FAM，用于指示熒光信號；3’端標記了特定的熒光淬滅基團Quencher，比如TAMRA，它可以吸收熒光基團發出的光，使其淬滅，這就是熒光共振能量轉移（FRET）。因此一條完整的探針理論上是不會發出熒光的，因為熒光基團發出的光都被淬滅基團所吸收，但當探針被水解掉之后，其結構不再完整，淬滅基團就不能吸收熒光了。

　　Figure 1. 探針法熒光定量的原理示意圖

　　 理論上，每擴增一個循環，N個靶標分子產生出2N個新分子，同時會產生N個新的reporter，因此熒光信號就與產物的量成正比。在循環開始之前和結束之后都分別測定reporter和quencher的熒光強度（在整個PCR過程中quencher的熒光強度基本保持一致），RQ+為循環結束后的reporter強度除以quencher的強度，RQ-為循環開始前的reporter強度除以quencher的強度，該循環的熒光強度△RQ=RQ+-RQ-。在反應的初期，參與反應的“原材料”是充足的，PCR是指數擴增，△RQ也是呈指數增加的，但是初始的熒光分子數目太少，熒光需要累積到一定的循環數后才能被CCD檢測到，這段時期叫做背景期（Baseline，Fig. 2）。背景期后為指數擴增期，在該時期PCR反應一直維持指數擴增，直到原材料接近耗盡后，才開始逐漸進入平臺期，熒光信號不再變強。對于qPCR來講，指數擴增期才有意義。