實驗概要
1. CRISPR的介紹：
CRISPR的全稱為Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(規律成簇的間隔短回文重復序列)。實際上就是一種基因編輯器，由于細菌自身具有降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制，從而科學家發現了CRISPR系統。也就是說，一些具有逆轉錄功能的病毒（如：慢病毒）能把自己的基因整合到細菌上，細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，從而進化出CRISPR系統。 2. CRISPR的元件：
CRISPR系統包含兩個組件，一個是sgRNA，另一個就是Cas 9蛋白。sgRNA是一個短的合成RNA，只有20bp大小，可以與Cas9蛋白結合，所以在設計sgRNA之前，應在基因組上尋找PAM序列（PAM：Protospacer Adjacent Motif），PAM序列是有固定形式的，來自于不同菌種屬的Cas，它的PAM序列形式是不一樣的。我們現在用的是SpCas 9，Cas 9蛋白來源于S. pyogenes （化膿鏈球菌）II型CRISPR系統。所以，我們的PAM序列應該為-NGG的形式，“N”可以是A,T,C,G中的任何一個。Cas 9其實就相當于是限制性核酸內切酶，使PAM序列前形成DSB（Double Strand Break）。所以，sgRNA其實相當于是向導，告訴Cas 9蛋白在哪進行切割。
所以，我們要做的就是將設計好的sgRNA進行合成，并將其連接到含有Cas 9的載體上。并轉化到Stellar、Stable或Stable3感受態中，進行表達。
實驗原理
規律間隔成簇短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）本身是一種防御系統，用以保護細菌和古細菌細胞不受病毒的侵害。在這些生物基因組中的CRISPR位點能表達與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子RNA 。當微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA就能通過互補序列結合病毒基因組，并表達CRISPR相關酶，也就是Cas，這些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA ，阻止病毒完成其功能。該切割DNA的機制與2012年被證實廣泛適用于真核生物，從而引發了后續的以CRISPR/Cas9為基礎的第三代基因編輯工具的研究熱潮。在真核細胞中雙鏈的DNA斷裂（Double strand break, DSB）可以引發兩種修復機制，其中非同源末端結合（Non-homologous end joining, NHEJ）可以產生數個堿基的隨機刪除或插入，從而引發移碼突變，這便是基因編輯工具進行基因敲除的原理；此外在有同源序列存在時可以進行同源重組修復，該機制可以實現外源基因的敲入或者定點修飾。
相比前兩代基因編輯工具ZFN系統和TALEN系統，CRISPR/Cas 9技術的優點比較顯著。首先，CRISPR-Cas9系統的可用位置更多。理論上基因組中每8個堿基就能找到一個可以用CRISPR-Cas9進行編輯的位置，可以說這一技術能對任一基因進行操作，而TALEN和ZFN系統則在數百甚至上千個堿基中才能找到一個可用位點，這大大限制了使用范圍。其次，Cas9擴展性強，正如本公司使用的Cas9n，是一種只進行單鏈切割的Cas9突變型，該酶可以大大降低切開雙鏈后帶來的非同源末端連接造成的染色體變異風險。此外還可以將Cas9蛋白連接其他功能蛋白，來在特定DNA序列上研究這些蛋白對細胞的影響。第三，更為重要的是，CRISPR-Cas9系統的使用極為方便，只需要替換一段核酸序列，幾乎任何實驗室都可以開展工作。
主要試劑
一、所需試劑：
1. PCR聚合酶：
實驗步驟
1. sgRNA的設計：
（1）sgRNA的設計原則：
1）sgRNA的長度：S. pyogenes II型CRISPR系統（SpCas 9）一般為20nt。
2）sgRNA序列的堿基組成：基因特異的sgRNA 模板序列為位于PAM 序列前，PAM序列的特征為NGG (N可以為任意核苷酸)，所以選擇3'末端含有GG的sgRNA，這樣可以構成PAM序列。同時，sgRNA的序列應避免以4個以上的T結尾，GC%含量最佳為30%-70%（40%-60%）。
3）sgRNA的序列與On-target和Off-target的匹配數都應盡可能的高，一般大于60，認為是可用的。
4）如果構建U6啟動子或T7啟動子驅動sgRNA的表達載體，需要考慮sgRNA的5'堿基為G或GG，來提高其轉錄效率。
5）全基因的脫靶效應分析，需要考慮脫靶位點的錯配堿基數，最多不超過5個。
6）如果想要造成基因移碼突變，需要盡量靠近基因編碼區的ATG下游，最好位于第一或第二外顯子上。
（2）sgRNA的設計步驟
通過網址：https://www.deskgen.com/landing/cloud進行sgRNA的設計，進入網址后點擊KNOCK OUT進入設計頁面，輸入想要設計sgRNA的名稱后，進行sgRNA的選擇。由于內含子在基因表達的過程中，不會進行表達且會被刪掉，所以我們在設計sgRNA時一般在靠近啟動子的第一個CDS區（也就是外顯子的保守結構域）進行sgRNA的選擇。在網站上，On-Target和Off-target都是有評分的，一般來說，評分越高，則sgRNA越好。On-Target其實就是sgRNA對目標位點識別后與DNA模板進行識別切割的的效率，所以準確性越高，On-Target的評分越高。Off-Target也就是脫靶效應，由于CRISPR技術的切割是由sgRNA根據PAM序列定位識別位點，從而進行切割，但是如果sgRNA識別的位點是錯誤的，就產生了錯誤切割，這樣就產生了脫靶效應。所以說，在進行sgRNA選擇的時候，要盡可能地選擇脫靶效率比較低的，也就是Off-target分值比較高的。另外，符合sgRNA的其它設計原則就可以了。
2. PCR擴增
1. 反應體系：
Mix | 12.5 μL |
R | 0.75 μL （10pmol/ μL） 5-7.5 pmol |
F | 0.75 μL （10pmol/ μL） 5-7.5 pmol |
模板 | <100 ng |
ddH2O | Up to 25 μL |
Total | 25 μL |
2. 反應程序：
1）模板少于100 ng：30-35 cycles
變性 | 退火 | 延伸 |
98℃ | ℃ | 72℃ |
10 sec | 5-15 sec | 5 sec/kb |
2）模板大于100 ng：30-35 cycles
變性 | 退火 | 延伸 |
98℃ | ℃ | 72℃ |
10 sec | 5-15 sec | 30-60 sec/kb |
【退火溫度】退火溫度是根據設計的引物決定的，不同的引物對，退火溫度不同。
【延伸時間】不同的模板大小，延伸的時間是不一樣的，一般1 kb/min。
3. 電泳驗證：
1）瓊脂糖凝膠制備：
瓊脂糖用量 | 1× TAE Buffer |
0.2 g | 25 mL |
0.4 g | 45 mL |
0.8 g | 85 mL |
加入 SYBR Safe DNA stain 3-5 μL |
2）電泳緩沖液配方：（1 L）
50× TAE Buffer | ddH2O |
200 mL | 980 mL |
將50× TAE Buffer稀釋成1× TAE Buffer。
3）點樣量：5 μL樣品 5 μL 10× Loading Buffer
4）120 V，電泳30 min。
PCR產物純化
（1）將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并將目的條帶進行膠回收。
（2）膠回收過程：
① 先準備1個新的1.5 mL的離心管，并稱量管子重量。例如：1號離心管重量為A g。
② 將目的條帶的紫外燈下進行切膠回收。將切下的膠放到1號離心管中，并稱重。例如：1號離心管加切目的條帶的膠總重為B g。
③ 計算切割的目的條帶的膠的重量。（B-A）g
④ 每100 mg的膠加200 μL的NT1，加入NT1后，旋渦振蕩1 min，50℃孵育5-10 min。每隔2-3min拿出來，旋渦振蕩30 sec，直到膠全部溶解，作為樣品。
⑤ 純化柱放在洗脫柱上后，加700 μL的樣品到洗脫柱上，11000 g，離心30s。（如果需要的話，此步驟可重復一次）
⑥ 將洗脫柱中的流液倒掉，加入700 μL的NT3，11000 g，離心30 sec。
⑦ 重復步驟6一次。
⑧ 將洗脫柱中的流液倒掉后，將純化柱再放在洗脫柱上，11000 g，空離1 min。
⑨ 加入15-30 μL的Buffer NE或ddH2O。（如果DNA片段>1000 bp，Buffer NE或ddH2O需要加熱到70℃后，再進行洗脫。）
連接反應
1. T4 DNA ligase連接反應體系：
T4 DNA ligase | 1 μL |
Insert Gene | μL （<1 mg） |
Plasmid | μL （<1 mg） |
T4 DNA ligase buffer | 2.5 μL |
ddH2O | μL |
Total | To 20 μL |
混勻后，室溫培養10 min。用于轉化。
2. In-fusion 連接反應體系：
5× In-fusion HD Enzyme Premix | 2 μL |
Insert Gene | μL （10-200 ng） |
Plasmid | μL （50-200 ng） |
ddH2O | μL |
Total | To 10 μL |
混勻后，50℃培養15 min。
【注意】
1）Insert Gene加入的量由其片段的大小決定：<0.5 kb, 10-50 ng；0.5-10 kb, 50-100 ng; >10 kb, 50-200 ng;
2）Plasmid加入的量由其片段大小決定：<10 kb, 50-100 ng; >10 kb, 50-200 ng。
3）For reactions with larger combined volumes of vector and PCR insert (>7 μL of vector insert), double the amount of enzyme premix, and add ddH20 for a total volume of 20 μL. 如果結合的體系比較大的話，也就是說insert vector大于7 μL，可以擴大反應體系，加ddH20到20 μL。
4）In-fusion反應的時間不能超過15 min，增加反應時間不僅不能提高克隆效率，反而可能引起多元插入的克隆反應。
5）In-fusion之前，應將insert和vector都進行DPn I消化，每管加2 μL DPn I，37℃，1h。去除PCR反應當中剩余的模板。
轉化
1. 將Stellar、Stable或Stable 3感受態放在冰上融化。
2. 2.5 μL In-fusion反應產物加到50 μL Stellar、Stable或Stable 3感受態中，冰置30min。
3. 42℃，熱激45 sec。
4. 冰置1-2 min。
5. 加入500 μL SOC培養基，37℃，160-225 rpm，培養1-1.5 h。（SOC培養基使用前要提前放到37℃搖床中復溫）
6. 6 000 rpm，離心5 min，去上清后，加入100 μL新鮮的SOC培養基，將沉淀吹散。
7. 將其按梯度涂在含有Amp抗生素的LB固體培養基上。37℃培養12-14 h。
8. 第二天，挑取單菌落，在含有Amp抗生素的LB液體培養基里培養12-14 h。
9. 提質粒，雙酶切驗證。
LB 固體培養基配方：（1L）
樣品名稱 | 用量 |
NaCl | 10 g |
酵母提取物 | 5 g |
蛋白胨 | 10 g |
瓊脂 | 15g |
ddH2O | 1 L |
LB 液體培養基配方：（1L）
樣品名稱 | 用量 |
NaCl | 10 g |
酵母提取物 | 5 g |
蛋白胨 | 10 g |
ddH2O | 1 L |
293T細胞培養
1. 將293T細胞的細胞上清倒掉后，用DPBS將細胞進行洗滌，除去死細胞及血清。
2.用胰蛋白酶對細胞進行消化，室溫靜置1min，用移液管將胰蛋白酶吸出。
3.消化后，用手敲培養皿，讓細胞沉到培養皿底部后，用細胞培養基再將細胞懸起，按1:6的比例稀釋。
培養瓶、培養皿的面積及規格：
（1）細胞培養皿:
產品編號 | 產品描述 | 建議上液量 |
430165 | 規格：35mm；高度：10mm；生長面積：200px2 | 3ml |
430166 | 規格：60mm；高度：15mm；生長面積：525px2 | 5ml |
430196 | 規格：60mm；高度：15mm；生長面積：525px2 | 5ml |
430167 | 規格：100mm；高度：20mm；生長面積：1375px2 | 10ml |
430293 | 規格：100mm；高度：20mm；生長面積：1375px2 | 10ml |
430599 | 規格：150mm；高度：25mm；生長面積：3700px2 | 30ml |
431110 | 規格：245mm(方形)；高度：25mm；生長面積：12500px2 | 100ml |
431112 | 規格：245mm(方形)；高度：25mm；生長面積：12500px2 | 100ml |
（2）細胞培養瓶:
產品編號 | 產品描述 | 建議上液量 |
430639 | 規格：625px2，矩形，斜頸，透氣蓋 | 5ml |
430641 | 規格：75mm2，矩形，斜頸，透氣蓋 | 15ml |
430825 | 規格：3750px2，矩形，斜頸，透氣蓋 | 30ml |
431080 | 規格：4375px2，矩形,角度頸,透氣蓋 | 35ml |
3001 | 規格：5625px2，矩形，斜頸，透氣蓋 | 45ml |
（3）細胞培養板：http://www.bio-equip.com/show1equip.asp?equipid=300277