1. 載體取2-5ug，在25ul體系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收載體：
載體:---2ul（2-5ug）
酶---------2.5ul
Buf--------2.5ul
水---------18ul
回收的時候希望濃度高點。
2. Oligo退火形成雙鏈
若為2OD=5.4nmol的話，則每個引物用54ul水溶解，即得到濃度為100uM（100pmol/ul）的溶液。
取兩引物各10ul，10X NEB Buf-2取2.2ul，混勻，PCR儀緩慢退火至室溫（>60min）。
程序如下：
95℃--------5min；
94~46℃--降1℃/min
46~26℃--降2℃/min
4℃---------forever
3. linker的5’端磷酸化
退火產物-------------0.5ul (50pmol總5’末端)
10x PNK Buf A-------2ul
10mM ATP------------2ul
T4 PNK酶------------1ul
ddH2O----------------14.5ul
以上總計20ul，混勻（不可votex），37度30min。
4. 連接
T4 DNA ligase法
酶切過載體----------100-200ng
磷酸化linker--------4ul 1:100稀釋后的linker
T4 酶------------------1ul
T4 Ligase Buf---------1ul
PEG4000--------------1ul
加水補足總體積10ul，混勻，4度過夜。