timsTOFPro和PASEF一雙慧眼探究更多組學奧秘

　　離子淌度技術發展幾十年，布魯克這個致力于挑戰極限的公司，2016年一出手就推出業界最高淌度分辨的timsTOF質譜，在完成硬件的挑戰后，布魯克同德國馬普研究所的Matthias Mann合作PASEF技術，于去年HUPO推出了timsTOF Pro，在蛋白質組學領域刷新了“鳥槍”法鑒定的速度、靈敏度和深度覆蓋率的記錄。今年ASMS上，分析測試百科網采訪到布魯克?道爾頓蛋白質組學副總裁Gary Kruppa博士，他將為我們進一步介紹timsTOF Pro的特性和用戶的反饋，希望對廣大的組學和精準醫學研究的用戶有啟發……

在TimsTOF Pro前的合影：布魯克.道爾頓蛋白質組學副總裁Gary Kruppa博士（右），分析測試百科網總經理卞利萍（左）

timsTOF Pro的特點和用戶評價

　　Gary博士首先回顧介紹了timsTOF Pro的原理和特點。離子淌度為LC-MS增加了除了液相保留時間、m/z外的新維度的分離，主要根據分子的形狀和大小進行分離，為復雜體系樣品的測定帶來了巨大的想象力。但在蛋白質組學這種超復雜的體系測定中，淌度分離時間一般為30-100毫秒，該段時間內的淌度分離時間就不再能接受LC流出的樣品，因此造成樣品的丟失，離子利用率大打折扣。

　　TIMS含義為：捕集離子淌度（trapped ion mobility），和傳統離子淌度只依靠電場力不同，TIMS利用電場力和氣流兩種作用的協同效果，可在較小的淌度裝置中獲得更高的淌度分離能力。而timsTOF Pro創新性地使用了雙TIMS分離/富集裝置，離子在第一個TIMS部分中進行累積，然后在第二個TIMS中根據淌度進行分離，經過分離后的離子繼續用于MS/MS碎裂。隨后重復該步驟，在該過程中，當第二個TIMS進行分離時，第一個TIMS也同時在平行地累積離子，這樣可以實現近乎100％的離子利用率。這種工作方式被稱為PASEF（Parallel Accumulation Serial Fragmentation平行累積串行碎裂）技術，由Matthias Mann 發明【1】。

雙TIMS工作模式：在氣流Vg導向力和電場力E的共同作用下，離子根據其淌度被捕獲在TIMS中進行累積，逐步降低電場力可序列地釋放離子（最大碰撞截面積的離子先流出）到Q-TOF中做MS/MS。使用PASEF方法的雙TIMS模式，離子在第二個TIMS中進行淌度分離時，第一個TIMS接收液相流出的樣品繼續進行累積，達到近100%的離子利用率

　　關于用戶的反饋，Gary博士談到了三點：

　　（1）提高靈敏度信噪比。在第二個TIMS淌度分離的100毫秒時間內，第一個TIMS持續累積離子，然后將離子壓縮成一個幾毫秒的包，迅速釋放到第二個TIMS中，這種時間聚焦效應和色譜聚焦技術類似，進一步提高了信噪比。Matthias Mann最新發表的論文表明，這種時間聚焦效應可提高信噪比50倍。【2】很多早期的用戶對timsTOF Pro大幅提升靈敏度的印象都非常深刻。

　　（2）系統非常穩定皮實。據Matthias Mann最新發表的論文表明，在連續操作1年半的時間內，他們只清洗了離子傳輸毛細管，沒有對離子源或其它裝置做任何維護，系統一直保持高性能。

　　（3）高靈敏度下的高速度。對于10ng的Hela酶解產物，僅用30分鐘即可鑒定約2,500種蛋白。該性能對于樣品量極少的蛋白質組學非常有吸引力，比如顯微切割的腫瘤活檢樣品，尤其當結合了皮實可靠的快速液相系統后，非常適用于高通量的蛋白質組學臨床應用。

　　（4）高精度的CCS測定。在平行多次測定中，timsTOF Pro顯示了極高的精度，CCS中位值絕對偏差僅為0.1%，比色譜保留時間的精度提高了10倍。CCS測定非常高的精度為基于譜庫的識別開辟了新的途徑，CCS參數在MS、MS/MS或非數據依賴的采集策略中增加了重要的證據。

　　（5）大幅提升蛋白鑒定的數量和覆蓋率。斯坦福大學中心實驗室的對比試驗表明，在肺、表皮、結腸、乳腺等組織的蛋白質組學測定中，timsTOF Pro的多肽匹配數量平均是Fusion的4.7倍。

　　Gary博士總結了timsTOF Pro對蛋白質組學的貢獻，timsTOF Pro上使用PASEF方法，憑借近100％的離子利用率，可以在母離子和子離子120Hz或更高的掃描過程中，在保持質譜超高分辨率的同時獲得更高的靈敏度，大幅增加序列覆蓋，并檢測到更多的翻譯后修飾和低豐度多肽。這對蛋白質組學的深入研究將產生巨大的推動作用。

中國的蛋白質組學研究：吸引更多學者歸國 大幅采納新技術

　　談到中美蛋白質組學客戶的對比，Gary博士表示，“雖然我沒有太多直接的經驗，但可以看到的整體趨勢是：中國大量投資于蛋白質組學、健康醫療和精準醫學（個體化醫療），吸引了大量我周圍的華裔科學家朋友們，回到中國開展蛋白質組學和精準醫學研究。中國正在為蛋白質組學和健康醫療投入大量的設施、人員和儀器設備。我認為投入金額可能比一些西方國家的總量更大。”

　　布魯克質譜中國區高級商業總監王克非博士補充說，“我認為如今中美的差別很小，因為現在有很多國際合作計劃。此前，美國科研人員會率先采用新技術，中國的科研人員常會等待新技術被證明成功后再開始采用新技術。但現在，越來越多的中國科研人員正在更多地開始早期的工作，他們正在嘗試應用最新的技術，比如去年9月推出的timsTOF Pro在蛋白質組學的應用。 所以，目前中美科學研究的差別很小，尤其是在采納新技術方面，幾乎是同時的。”

　　談到對中美貿易戰是否對質譜行業產生影響，Gary博士表示：目前尚未看到貿易戰對質譜領域產生影響。我希望領導人們盡快停止貿易戰，使我們可以繼續自由貿易。如果真有威脅的話，將會導致各方的價格提高。因為就質譜來說，目前尚沒有大量的質譜儀在中國制造，那么中國就會繼續購買，購買價格就會上漲。如果世界范圍內發生貿易戰，布魯克將為零部件等支付更高的價格，質譜儀購買國家也將支付更高的價格，貿易戰只會提高每個人的價格。

進入臨床質譜的前提：儀器的自動化和可靠性

　　臨床質譜應用目前是熱門話題，中國質譜學會不久前亦成立了臨床質譜專業委員會，Gary博士談到了布魯克質譜在此方面的特點，他表示：首先整套質譜系統要有很好的自動化和易用性；其次質譜必須非常皮實耐用。

　　在timsTOF Pro中，離子從TIMS注入到Q-TOF時采用垂直正交設計，使后續質譜保持非常干凈。如前文所述，Matthias Mann實驗室在連續操作timsTOF Pro達1年半的時間內，只清洗了離子傳輸毛細管，沒有對離子源或其它裝置做任何維護，系統一直保持高性能。而市場上有些儀器可能隨著時間推移性能下降，這也是布魯克儀器在設計上很大的特色。

　　在自動化方面，布魯克與Evosep公司今年3月開展合作，timsTOF Pro同Evosep One高度自動化的分離裝置集成，用于高通量臨床蛋白質組學分析。Evosep One是一種新的用于大隊列蛋白質組學的層析系統，優化的系統可進行每天200個樣本的分析。例證顯示，在5分鐘的梯度中，它的液相色譜峰寬約2秒，已與 PASEF 方法集成在 timsTOF Pro質譜中，后者的MS/MS采樣速度>150 Hz。新的組合提供了超高的靈敏度 (50ng HeLa) 和高通量，在5分鐘梯度內，可高通量鑒定約1,200種蛋白，并實現對1,000個多肽的定量。對于大型樣本群, 這使得生物標志物的研究和驗證可達到每天200個樣品的通量——這是臨床蛋白質組學研究的一個突破。

布魯克展廳內的Evosep One，用于大隊列蛋白質組學的層析系

同客戶合作創新 探究蛋白質組學更多奧秘

　　談及同客戶的合作，Gary博士表示，PASEF的方法是德國馬普研究所Matthias Mann教授提出的，布魯克和Matthias Mann教授一同開發出了timsTOF Pro，這是同客戶合作創新的典型案例。另外布魯克和德國馬普研究所的Jürgen Cox教授，合作開發了MaxQuant軟件，這是一種質譜數據庫搜索軟件，可進行蛋白質鑒定、SILAC定量、iTRAQ/TMT定量和無標記定量等分析。在DIA非數據依賴的采集策略，蛋白質組學定量方面，布魯克也在同客戶合作創新，未來將發布更多成果。

　　Gary博士表示， timsTOF Pro在蛋白質組學領域已展示出超乎人們想象的卓越性能，未來幾年，布魯克將圍繞該儀器進一步研發，比如DIA非數據依賴采集，靶向蛋白質組學等，將為timsTOF Pro增加更多的重要新功能。

今年將在精準醫學領域推新品

　　最后，筆者請Gary博士談談布魯克在精準醫學中的規劃。他表示，精準醫學對于每一個質譜公司來說都非常重要，布魯克將于今年推出更多新產品和軟件。“這是另一項正在談判中的合作，現在還不能公布。我們將在今年宣布該合作，并將我們的質譜轉化為提供精準醫學/個體化醫療服務的質譜。

　　儀器是個體化醫療的最佳工具。個體化醫療意味著你必須在一段時間內監測個人盡可能的日常指標，你應該衡量一下，如果你想做基于個人蛋白質組的個體化醫療，你必須知道在正常情況下該個體的蛋白質組是什么，測量基礎至少達到一個月，測定樣品是一滴血，并保持監測一個月，然后你將看到該個體的蛋白質組在改變。技術的關鍵點包括：從一滴血中測到盡可能多的蛋白質，質譜系統要求高靈敏度，高的序列覆蓋，并必須皮實可靠，可以每天測定數以百計的樣品。這是真正的目標。

　　我們可以測量個體的基因組，但基因組是不變的，它不能告訴你是否生病，而只能告訴你患病的傾向。因此你必須測定蛋白質組、代謝組，告訴你產生何種變化時你會生病。你可以定期測量蛋白質組、代謝組，這樣你可以獲知發生改變的時間。

　　因此，在精準醫學/個體化醫療方面，需要高通量、高靈敏度的質譜技術，timsTOF Pro正是理想的儀器之選。

　　參考文獻：

　　[1] J.Proteome Res. 2015,14,5378-5387, Parallel Accumulation – Serial Fragmentation (PASEF): Multiplying Sequencing Speed and Sensitivity by Synchronized Scans in a Trapped Ion Mobility Device

　　Florian Meier, Scarlet Beck, Niklas Grassl, Markus Lubeck, Melvin A. Park, Oliver Raether, and Matthias Mann

　　[2] Online parallel accumulation – serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Matthias Mann等

　　bioRxiv, June 1, 2018 https://www.biorxiv.org/content/early/2018/06/01/336743.full.pdf+html

　　采訪人簡介：

　　Gary Kruppa 博士是一名化學家，擁有超過38年的質譜研究經驗。作為蛋白質組學業務的副總裁, 他目前負責布魯克·道爾頓公司質譜在蛋白質組學的應用、應用開發和市場管理。2008-2016年，他作為布魯克業務發展副總裁，曾負責多方面的業務開發，包括首次向美國臨床微生物學實驗室市場和后來的制藥微生物學質控實驗室引入MALDI Biotyper。 在此之前, 他于1991年加入布魯克公司，于1998-2008年擔任布魯克副總裁。1982年，他獲得了特拉華州大學化學學士學位，1988年獲加州理工學院化學物理博士學位。

　　關于布魯克公司（納斯達克股票代碼：BRKR）

　　布魯克正在幫助科學家們取得突破性發現并開發新的應用來提高人類生活質量。布魯克的高性能科學儀器和高價值分析及診斷解決方案使科學家能夠在分子、細胞和微觀層面探索生命和材料。

　　在與客戶的密切合作下，布魯克致力于在生命科學分子研究、應用市場和制藥應用、顯微鏡和納米分析、工業應用、細胞生物學、臨床前成像、臨床表型組學和蛋白質組學研究以及臨床微生物學。 欲了解更多信息，請訪問：www.bruker.com。