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  • 發布時間:2022-05-17 13:09 原文鏈接: trizol法提取RNA的方法及每一步的原理

    實驗步驟:
    1. 提取組織RNA時,每50~100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解:提取細胞RNA時,先離心沉淀細胞,每5~106個細胞加1ml Trizol后,反復用槍吹打或劇烈震蕩以裂解細胞;
    2. 將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉入EP管中,在試問15~30℃下放置5分鐘;
    3. 在上述EP管中,按照每1mlTrizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿,蓋上EP管蓋子,在手中用力震蕩15秒,在室溫下(15~30℃)放置2~3分鐘后,12000g(2~8℃)離心15分鐘;
    4. 去上層水相置于新EP管中,按照每1mlTrizol加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇,在室溫下(15~30℃)放置10分鐘后,12000g(2~8℃)離心10分鐘;
    5. 棄上清,按照每1ml Trizol加1ml75% 乙醇進行洗滌,渦旋混合,7500g(2~8℃)離心5分鐘,棄上清;
    6. 讓沉淀的RNA在室溫在自然干燥;
    7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀

    各試劑的作用:
    1、 TRIZOL
    主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞,使細胞中的蛋白,核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質,但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase(RNA酶)。
    TRIZOL是從細胞和組織中提取總RNA的即用型試劑,在樣品裂解或勻漿過程中,TRIZOL能保持RNA完整性。加入氯仿后,溶液分為水相和有機相,RNA在水相中。取出水相,用異丙醇可沉淀回收RNA。
    ※0.1%的8-羥基喹啉可以抑制RNase,與氯仿聯合使用可增強抑制作用。
    ※異硫氰酸胍屬于解偶劑,是一類強力的蛋白質變性劑,可溶解蛋白質并使蛋白質二級結構消失,導致細胞結構降解,核蛋白迅速與核酸分離。
    ※β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。

    2、 氯仿
    為有機溶劑與水互不相溶,RNA(核糖核“酸”的鹽型)是離子化合物,溶于水相

    3、異丙醇
    能與與任意比例的水混合,因此加入異丙醇,能夠奪取RNA/DNA周圍的水分,RNA/DNA能夠聚集而發生沉淀。

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