TUNEL法檢測細胞凋亡操作步驟
操作步驟
1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min；
3.PBS漂洗2次；
4.用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C或者加細胞通透液8min；
5.PBS漂洗2次；
6.制備TUNEL反應混合液，處理組用50μl TdT＋450μl 熒光素標記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液，陽性對照組先加入100μl DNase 1，反應在室溫～37℃×10～30min，后面步驟同處理組。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反應混合液（陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液）于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×60min。
8.PBS漂洗3次；
9.可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞（激發光波長為450～500nm，檢測波長為515～565nm）；
10.玻片干后加50μl converter-POD于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30min。
11.PBS漂洗3次；
12.在組織處加50～100μlDAB底物，反應15～25℃×10min；
13.PBS漂洗3次；
14.拍照后再用蘇木素或甲基綠復染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。
15.加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡進行計數（200～500個細胞）并拍照。