可反復凍融的次數具體情況根據目的蛋白性質（主要是穩定性）而定，當然，最好是一次成功。如果說需要做大量的實驗，需要一次準備很多一致性蛋白樣品，那么強烈建議你在第一次冷凍前用EP管分裝，分裝數量和分裝量根據你的實驗次數和需要一次上樣量確定。這樣，就完全避免了多次凍融（除了第一次實驗不需要凍融；這是從根本上解決你的問題）。
再說你提的問題本身，上面也說了，蛋白樣品可反復凍融的次數，要根據目的蛋白性質（主要是穩定性）而定，這是說如果你需要的目的蛋白比較穩定，那么，是可以多次反復凍融的，但最好不要多于3次，因為蛋白質在反復凍融下，會變性，而且，儲存時間太長了，也會影響實驗數據的準確性。一般而言，-20度保存，不要超過2周，最長不要超過1個月；-80度（或-70度）保存，一般不超過半年，最多1年。提一句，新取得樣本，如果不是立即提取蛋白，最好立即保存在液氮中（很方便），尤其是如果你還要做RNA實驗的話，因為只有在液氮的超低溫環境下，才能抑制RNA酶的活性，而RNA酶是無處不在的。
如果是做非變性western的話， 或者是研究蛋白質間的互作（如細胞信號轉導），如IP等， 那么最好是用新鮮的蛋白，因為反復凍融會嚴重破壞蛋白的空間結構和結合蛋白。還有一些小分子
和易分解、變構、不穩定蛋白，也應盡量避免多次凍融。
內參蛋白，如GAPDH和β-actin等，都是些比較穩定或者是經過修飾的在胞中穩定表達的基準蛋白，它們和marker蛋白都是比較穩定的蛋白（或者說的蛋白片段），而且在它們的Buffer中，都添加了穩定劑（或者說是變性劑），是可以多次反復凍融的（這在它們的說明書里應該都有說明）。
ERK蛋白，或者說ERK蛋白家族（至少包括5個亞族），是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是Ras/Raf/MEK/ERK信號轉導途徑中重要的一個成員，如果您是做信號轉導的話，建議您最好是用新鮮蛋白，盡量避免反復凍融。
至于您說的marker轉上了而目的蛋白沒轉上，我想，這要從您的實驗本身來分析，因為WB影響的因素太多了。舉個例子來說：您的蛋白提取成功嗎？蛋白樣品合格嗎（純度、濃度，提取液等）？您的樣品上樣前如何處理的（是哪種電泳？哪種膠？用的哪種Buffer？需要煮嗎？需要離心嗎？)？您的上樣量是多少？您的目的蛋白的理論濃度是多少還是未知？您目的蛋白的大小是多少？您的電泳液合適嗎？您的轉膜時間合適嗎？您的轉膜電壓或者電流合適嗎，您的轉膜溫度控制在多少？您轉膜完成后如何處理的膜？您使用了合適的封閉液了嗎？您的選用的抗體濃度合適嗎？孵育時間夠嗎？洗膜液和洗膜時間合適嗎？發光時間夠嗎？等等