Westerns blot是分析蛋白表達的有力技術。通過這種測定方法，可以評估單個蛋白的分子量，翻譯后修飾蛋白和蛋白表達豐度。 蛋白印跡相對簡單，不需要昂貴的設備或試劑，使其成為許多實驗室蛋白檢測方法。
成功的western blot的關鍵是使用與單一蛋白特異性反應并且與其他蛋白幾乎沒有交叉反應性的抗體。 成功的western blot還依賴于獲得信號：信噪比，其允許以最小背景檢測蛋白。均勻高背景和不均勻斑點背景是Western blot中的常見問題。 下面描述Western blot中產生高背景的常見原因和解決方案。
均勻的高背景
均勻的高背景是使整個印跡變暗的背景，使得難以看到特定的條帶。均勻背景可能由多種原因造成。
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抗體濃度過高
如果使用過高濃度的抗體，它們可能與印跡膜發生非特異性結合。 這將導致整個印跡的均勻高背景。 當使用超敏化學發光（ECL）時，有時噪音點甚至會在黑暗中發光。
解決方案
滴定抗體
為了降低由于高抗體濃度導致的高背景，需要滴定抗體，滴定一抗和二抗濃度。
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封閉不足
封閉膜是阻止抗體與膜非特異性結合的關鍵步驟。 通過在合適的封閉緩沖液中孵育印跡來實現充分的封閉。 封閉劑的類型，孵育的時間和溫度可影響封閉效率。
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封閉試劑
封閉試劑的選擇取決于特定的抗原：抗體相互作用，并且最好根據經驗確定。
脫脂奶粉是常用的封閉液。 通常建議使用5％的牛奶來封閉，但有時這種高濃度牛奶會掩蓋被檢測的蛋白，特別是如果表達量低的情況下。 我們建議從1％牛奶開始。
牛奶可能與某些抗體和檢測系統不相容，在這種情況下，3％牛血清白蛋白（BSA）是可以使用的第二種基于蛋白質的封閉試劑。
一些公司銷售無蛋白封閉試劑， 不含蛋白的試劑可防止干擾，但也可與蛋白類封閉液聯合使用，以增加封閉能力。
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孵化的時間和溫度
在室溫下通過搖床封閉孵育1小時或在4℃下攪拌孵育過夜進行封閉。
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來自不兼容的封閉劑干擾
當封閉劑與抗體相互作用引起干擾時，可以觀察到均勻的高背景。 例如，抗體可以與基于蛋白質的封閉劑中的蛋白質結合并導致高度均勻的背景。含有未純化的一抗動物血清可以與封閉試劑中的動物蛋白結合。 此外，脫脂奶粉可以與某些抗體或檢測試劑發生特異性反應。牛奶中含有酪蛋白，一種可與磷酸特異性抗體反應的磷蛋白。 牛奶還含有可變量的抗生物素蛋白，可以干擾抗生物素蛋白 -生物素檢測系統。 這兩種相互作用都會產生高度均勻的背景。
解決方案
測試不同的封閉劑
應確定每種抗原：抗體組合的適當封閉試劑。 如上所述，兩種最常見的封閉劑是脫脂奶粉和牛血清白蛋白。 如果這些封閉劑都不合適，則可以使用無蛋白或非動物蛋白質封閉試劑，例如Azure Protein-Free Blot Blocking Buffer是一種無蛋白封閉溶液，針對熒光印跡進行了優化。它還可作為化學發光蛋白印跡的優異封閉試劑。
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漂洗不足
在與一抗和二抗孵育后充分漂洗印跡以去除過量抗體是重要的。 漂洗不良會導致背景不均勻。
解決方案
改變漂洗體積，時間和漂洗次數
增大漂洗液用量， 推薦的方案是在每次孵育后漂洗膜3次，每次漂洗5分鐘。 可以增加洗滌次數和洗滌時間以提高洗滌效率； 然而，過量漂洗會降低信號強度。