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問題 |
可能原因 |
驗證或解決辦法 |
| 轉膜不充分 | 膜沒有完全均勻濕透 | 使用100% methanol浸透膜 |
| 靶蛋白分子量小于10,000 | 選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間 | |
| 靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液pH 值 | 可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液 | |
| 甲醇濃度過高 | 過高甲醇濃度會導致蛋白質與 SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替 | |
| 轉移時間不夠Thick gel | 對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間 | |
| 背景高 | 膜沒有完全均勻濕透 | 使用100% methanol浸透膜 |
| 洗膜不充分 | 增加洗液體積和洗滌次數 | |
| 阻斷不充分 | 增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等） | |
| 二抗濃度過高 | 降低二抗濃度 | |
| 檢測過程中膜干燥 | 保證充分的反應液，避免出現干膜現象 | |
| 曝光過度 | 縮短曝光時間 | |
| 抗體與阻斷蛋白有交叉反應 | 檢測 抗體與阻斷蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應 | |
| 沒有陽性條帶 | 抗體染色不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
| 酶失活 | 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物 | |
| 標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。 | |
| 試劑不匹配 | 一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性 | |
| 一抗失效 | 選擇在有效期內抗體；并選擇現配現用的工作液 | |
| HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 | |
| 有陽性條帶，但條帶比較弱 | 抗體染色不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
| 酶活性降低 | 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物 | |
| 標本中靶蛋白含量太低 | 增加標本上樣量。 | |
| 洗膜過度 | 縮短洗滌時間 | |
| HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 | |
| 抗體活性降低 | 選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置 | |
| 蛋白轉移不充分 | 見上述 | |
| 封閉過度 | 減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑類型 | |
| 曝光時間過短 | 延長曝光時間 | |
| HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 | |
| 條帶位置（大小）不對；或有非特異性條帶 | 二抗的非特異性結合 | 增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的） |
| 一抗的特異性不夠 | 使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性 | |
| 蛋白降解 | 使用新鮮制備的標本，并使用 蛋白酶抑制劑 | |
| 二聚體或多聚體存在 | 增加蛋白質變性過程及強度 | |
| 抗體濃度過高 | 降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶 | |
| 蛋白上樣量過大 | 降低上樣量 | |
| 背景有斑點 | 封閉劑中有聚集體 | 使用前過濾封閉試劑 |
| HRP耦聯二抗中有聚集體 | 過濾二抗試劑，去除聚集體 | |
| 膜上出現反像（暗背景上白色帶） | HRP含量過高 | 降低酶聯二抗的濃度 |