一．配膠
1． 注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。
2． 分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可
3． 封膠：灌入2/3的分離膠后應立即封膠，膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。
4．灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正；若變形嚴重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長時間有利于膠結構的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內部分子的排列尚未完成。
二．樣品處理
1．培養的細胞（定性）：
⑴ 去培養液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。
⑵ 對于6孔板來說每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。
⑶ 100℃，1min。
⑷ 用細胞刮刮下細胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。
⑸ 用干凈的針尖挑絲，如有團塊則將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現象，則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。
⑹ 待樣品恢復到室溫后上樣。
2．培養的細胞（定量）：
⑴ 去培養液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。
⑵ 加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶ 用細胞刮刮下細胞，收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。
⑷ 12000g離心，4℃，2min。
⑸ 取少量上清進行定量。
⑹ 將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。
3．組織：
⑴ 勻漿 對于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。
⑵ 12000g離心，4℃，2min。
⑶ 取少量上清進行定量。
⑷ 將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。
三．電泳
1．上樣前將膠板下的氣泡趕走。
2．所有蛋白樣品調至等濃度后上樣，樣品兩側的泳道用等體積的1×loading buffer上樣，Marker也用1×loading buffer調整至與樣品等體積。
2．以初始電壓為45V時的電流強度進行穩流電泳，當電壓達65V時改為穩壓電泳。
3．在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結束。
四．轉膜
1．電泳結束前20分鐘左右戴上手套開始準備：
濕轉使用常規電轉液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去離子水至1,000ml。干轉則取此轉移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉入轉移液中。將濾紙也浸入轉移液中。
2．取膠：
將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側一張（干轉每側三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是干轉，以防止短路）
3．轉膜：
濕轉：電轉槽用去離子水淋洗晾干，加入1,000ml電轉液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉液再次驅趕氣泡，封緊后放入電轉槽，注意膜在正極一側。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干轉：用電轉液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉移1-2小時。負載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。