五．封閉及雜交
1．封閉：
將膜從電轉槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。
2．結合一抗：
一抗的準備：使用反貼法時每張3×9cm2膜約需2ml一抗稀釋液。
反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4℃靜置過夜。在反應體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發。
3．洗滌：
一抗孵育結束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4．結合二抗：
根據一抗來源選擇合適的二抗，根據鑒定方法選擇HRP或AP標記的抗體，按相應比例稀釋（1:1000~1:10000），室溫輕搖一小時。
5．洗滌：
二抗孵育結束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
六．發光鑒定
一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。
1．HRP-ECL發光法：
將A、B發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。
2．AP-NBT/BICP顯色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個
EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現時將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。
七．增強敏感性
若目的條帶未出現，或很淡，可試用以下方法增強發光強度：
1． 用清水漂洗膜數分鐘，重加發光液進行曝光，可延長曝光時間。
2． 將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長，期間至少換2次液。
3． 封閉40~60min
4． 一抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會更強，但可能增加非特異條帶。
5． PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。
6． 二抗雜交，37℃ 1h。
7． PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。
8． 發光鑒定。
9． 若條帶仍未出現或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。
10．三抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會更強，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。
11．PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。
12．發光鑒定。
八．NC膜的多次使用
一張NC膜可使用多次，對多種蛋白進行雜交，步驟與“七．增強敏感性”相近。
1． 如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置差別較大則只需用PBST洗滌掉發光液（10min×3次）后從一抗雜交開始，后續步驟同前。
2． 如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置較近則需更強的洗滌，可用 strip液（可用雜交袋）于室溫搖動洗滌30min~60min，然后用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，后續步驟同前。
3． 對于雜交若干次的膜，如果常規洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強度更強的自配的strip液（可用雜交袋）于50℃洗滌30min，然后用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，后續步驟同前。