xCELLigence系統內源性GPCRs細胞功能研究（一）

xCELLigence系統實時評測內源性G-偶聯蛋白受體（GPCRs）功能

Jeff Irelan 美國圣地亞哥ACEA Biosciences 公司
Jonathan H. Morgan 美國弗吉尼亞州Manassas ATCC 產品經理

前言

    G-偶聯蛋白受體（GPCRs），即 7-跨膜蛋白，是當今臨床與科研藥物的單一治療靶點，也是迄今發現最大的靶點家族。據推測人基因組中，該家族的功能成員超過300個，涉及多種不同細胞與組織間的廣泛信號途徑。研究證實，對GPCR功能的調節，有助于免疫學、神經病學、心臟病學與腫瘤學領域多種疾病的治療。
通過應用新的基于細胞水平的受體功能檢測技術，候選藥物對新調節子的確認率顯著提高，損耗率（定義為臨床前檢測/臨床試驗失敗率）降低。但基礎研究獲得的GPCR 功能數據很難被應用于臨床疾病中。造成這種情況的原因是，傳統細胞學實驗往往（1）使用異源細胞，或相關性較低的細胞類型，進行人造受體的過表達；（2） 使用外源性檢測試劑，如熒光標記試劑；（3）使用侵入性處理手段，像染料負載以及細胞裂解，（4）生成的數據僅為單一時間點的數據，而不是持續性細胞監測數據。
    最近開發的生物相關性程度更高的實驗系統，可顯著改善 GPCR 藥物開發與研究應用的成功率(1)。羅氏應用科學部的 xCELLigence 系統，不需要使用外源性標記，即可對疾病相關細胞的內源性GPCR功能進行實時評測。將細胞接種于含有微電極的培養板上，可對GPCR 激活導致的細胞骨架結構的微小變化與細胞收縮情況進行準確測定。
    通過與細胞漿鳥嘌呤核苷結合蛋白或 G 蛋白結合偶聯，GPCRs 可進行細胞的信號傳導活動。所有主要的與 G 蛋白偶聯的第二信使通路，都已被發現會激活環化AMP/蛋白激酶 A、鈣離子/磷酸酶 C、β-抑制蛋白/MAPK，以及 Rho 家族 GTP酶，使細胞發生形態學改變。而xCELLigence 系統可通過記錄細胞阻抗，很容易對形態學改變進行檢測(2)，從而完成對GPCR的檢測。
    與傳統檢測方法相比，形態學阻抗測定可對多個信號途徑累積效應進行捕獲。內源性GPCR 功能測定的優勢包括（1）對靶受體進行評價是在其正常表達水平上；（2）在調節因子包括激素或異源性二聚體存在情況下，對受體之間的天然相互作用情況進行分析；（3）允許 GPCR 與細胞內 G 蛋白的天然偶聯。同時，應用實時無標記xCELLigence 檢測系統，可動態實時地記錄實驗期間的所有阻抗信息，從而對所有GPCR的反應進行檢測。通過單一檢測即可對 GPCR 激活導致的所有第二信使途徑進行測定，從而有效降低試劑成本。
本研究中，我們發現 xCELLigence 系統是一種靈敏的、可靠的檢測系統，用于持續內源性 GPCR 功能測定。研究中我們對涉及 24 個治療相關受體家族的一組 43 個配體（參見表 1）進行了測定，并生成了相關GPCR功能圖譜。實驗涉及通用的腫瘤細胞系、HeLa、U2OS、SH-SY5Y 與 CHO-K1，以及疾病相關的原代細胞：人血管內皮細胞與混合腎上皮細胞。

表 1：GPCR 功能圖概述