Ⅰ型出血熱患者中性粒細胞與淋巴細胞功能變化研究

作者：劉亦芬　高斌　劉璉

單位：劉亦芬（100091 北京, 中國中醫研究院西苑醫院檢驗科）；高斌（合肥市第一人民醫院）；劉璉（安徽醫科大學微生物教研室）

關鍵詞：腎綜合征出血熱；中性粒細胞；淋巴細胞；Hantaan病毒

　　【 摘要 】　目的　研究腎綜合征出血熱（HFRS）患者的淋巴細胞和中性粒細胞免疫功能變化及其相互間關系，進一步闡明發病機理。方法　采用Ea、Et花環形成、PHA皮膚試驗及中性粒細胞趨化、吞噬、NBT還原等多種試驗方法同時對32例由Hantaan病毒引起的姬鼠型HFRS患者的淋巴細胞和中性粒細胞免疫功能變化及其相互間關系進行動態測定。結果　HFRS患者早期前五項指標均明顯低于正常人(P＜0.01)；病程中，淋巴細胞損傷程度較粒細胞更加突出；中性粒細胞NBT還原能力在恢復期反降至最低 (P＜0.05)。此外，患者這兩種細胞的免疫功能在恢復期并未能完全達到正常水平。結論　HFRS患者淋巴細胞免疫功能損傷程度與病程密切相關，可能是Hantaan病毒直接作用的結果；而中性粒細胞免疫功能變化比較復雜，有待進一步研究。恢復期患者細胞免疫功能未能完全恢復提示臨床治療應予以關注。

　　Research on functions of polymorphonuclear neutrophil and lymphocyte in HFRS patients infected with Hantaan virus　LIU Yifen*, GAO Bin, LIU Lian. *Xiyuan Hospital, Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100091

　　【 Abstract 】　Objective　To clarify the pathogenesis of the hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), the investigations on the immune functions of polymorphonuclear neutrophil and lymphocyte in HFRS were made.Methods　The total and the activated erythrocyte rosette forming cell counts, phytohemagglutinin skin test, chemotactic and phagocytic activities as well as the nitroblue tetrazolium (NBT) dye reduction were respectively performed on 32 HFRS patients infected with Hantaan virus. A dynamic observation on the function change of the patients' polymorphonuclear neutrophil and lymphocyte was done simultaneously. The statistical table and chart were given for the test results. The dynamic changes of polymorphonuclear neutrophil and lymphocyte's functions were showed schematically.Results　The results showed that all these functional indices except for NBT of HFRS patients decreased sharply (P＜0.01) in febrile and oliguria phases compared with those of the normal group. Relatively, the activities of lymphocyte in HFRS patients were even more severely depressed. The reduction of nitroblue tetrazolium dye of polymorphonuclear neutrophil , however, was found to be lowest (P＜0.05) in the convalescence phase. Also in this phase, most of immune functions tested in present research were not perfectly recovered.Conclusions　 The functional changes of lymphocyte in HFRS are closely related with the patients' different phases (febrile, oliguria, diuria and convalescence). It is probable the direct role of Hantaan virus-infection. Further more investigations are required to clarify the immune functions of polymorphonuclear neutrophil in HFRS because of its complicate responses. Attentions in clinic should be paid to the patients in convalescence phase.

　　【 Subject words 】　Hemorrhagic fever with renal syndrome　　Polymorphonuclear neutrophil　　Lymphocyte　　Hantaan virus

　　近年來對腎綜合征出血熱（HFRS）發病機理的研究報道很多。多方面實驗結果都證實了HFRS病人的細胞免疫和體液免疫功能的紊亂，表現為細胞免疫功能低下，體液免疫功能亢進〔1〕。但目前尚未見有文獻報道對HFRS病人同時進行淋巴細胞（Lym）和中性粒細胞（PMN）功能變化的檢測、比較及它們與病程內在關系的研究。我們采用多種方法對32例由Hantaan病毒引起的姬鼠型HFRS病人外周血中性粒細胞和淋巴細胞的功能同時進行了動態觀察研究，并探討了HFRS病人的病程與中性粒細胞及淋巴細胞功能之間的關系。為治療及研究HFRS提供了實驗參考。

　　材料和方法

　　1.檢查對象： 選自安徽省鳳臺縣人民醫院內科住院病人，經臨床及血清學檢查確診為HFRS患者(1992年)，經流行病學調查及分析（包括血清學及PCR分型）屬由Hantaan病毒引起的Ⅰ型出血熱。正常對照為疫區健康獻血員。

　　2.外周血Lym和PMN分離方法：肝素抗凝血(25U/ml) 加2倍量的無鈣鎂Hanks液，混勻后疊加于淋巴細胞分離液（上海試劑二廠）上2000r/min離心20分鐘，收集單個核細胞層，無鈣鎂Hanks液洗2次，用含2%小牛血清的無鈣鎂Hanks液配成所需濃度的Lym懸液。同時沉淀細胞加等量3%右旋糖酐（上海長征制藥廠，相對分子質量420×103）混勻后，置37℃，30分鐘 后收集PMN層離心沉淀，Hanks液洗1次，加Tris-NH4Cl溶解殘余紅細胞，其余處理同Lym，配制成所需濃度的PMN懸液。

　　3.PHA皮膚試驗：PHA（廣州醫藥研究所生產）無菌生理鹽水稀釋成200μg/ml。取0.1ml 注射前臂皮內，24小時后測量紅斑直徑。

　4.E花環試驗：按全國統一操作流程并略加改進，具體步驟為： 1）Ea花環試驗, Lym與綿羊紅細胞（SRBC）比例1∶20，取Lym 懸液0.1ml加0.1ml SRBC懸液，混勻后立即1000r/min離心 5分鐘 ，取出全部上清再返加2滴，輕輕搖勻后加入2滴0.8%戊二醛，置4℃冰箱固定15分鐘，攤片、干燥、染色、油鏡計數，算出Ea花環形成率； 2）Et花環試驗，Lym與SRBC比例1∶60，等量Lym與SRBC懸液混勻，置37℃水浴中溫浴10分鐘后1000r/min 離心5分鐘，置4℃冰箱過夜。以下步驟同上。

　　5.PMN吞噬試驗：Pereira法和Wood法并加修改〔2，3〕。0.1ml白色念珠菌懸液（8×107/ml）加0.8ml PMN懸液（2.5×106/ml），加正常人血清0.1ml混勻，置37℃水浴1小時，1000r/min 離心5分鐘，棄上清、沉淀細胞、攤片、油鏡計數，算出PMN吞噬率。

　　6.PMN趨化試驗：參照有關文獻〔4〕，用3ml 1%瓊脂糖（用Hanks液配制0.5%水解乳白蛋白）加熱熔化至50℃時加0.3ml滅活小牛血清，混勻后鋪于75.7mm×25.5mm載玻片上，冷卻后打孔。每塊板打上中下3行，每行6孔。上行加正常人混合血清10μl作趨化因子；中行加PMN懸液10μl(4×107/ml)；下行加Hanks液作對照，置濕盒內37℃溫育6小時，室溫干燥，固定，染色后鏡檢。用刻度目鏡測微尺測量細胞趨化移動距離（A）和隨機移動距離（B），算出趨化指數A/B。

　　7.PMN的NBT還原試驗：參照文獻〔5〕。

　結果與討論

　　從表1可見：HFRS患者發熱期、少尿期的PHA皮膚試驗紅斑直徑明顯小于正常人，而到多尿期呈上升趨勢，至恢復期接近正常水平；PMN趨化指數也在早期有明顯降低(P＜0.01)，到多尿期和恢復期PMN趨化活性逐漸增強，且稍高于正常水平。但PMN的NBT還原能力則略有不同，在發熱期接近正常水平，少尿期、多尿期呈下降趨勢，但仍與正常組無顯著性差異(P＞0.05)，可是到了恢復期PMN的NBT還原能力卻明顯低于正常組(P＜0.05)。

　　　　　　表1　HFRS病人PHA皮膚試驗及PMN趨化、NBT還原功能檢查結果

　　圖1表明，HFRS病人在發熱期Ea、Et花環形成率明顯低于正常人(P＜0.01)，少尿期降至最低。Et花環形成率在多尿期、恢復期逐漸上升，接近正常水平；Ea花環形成率也在多尿期開始上升，但直到恢復期仍維持較低水平，且與正常組差異有顯著性(P＜0.01)。而PMN吞噬功能測定表明，HFRS發熱期較正常組有明顯降低(P＜0.01)，以后迅速恢復到正常水平。

　　圖1　HFRS病人各期淋巴細胞Ea、Et花環形成率及PMN吞噬能力與正常人比較

　我們對實驗結果進行歸一化處理，即將正常對照組的Lym與PMN功能實驗結果視為單位1，將HFRS病人在不同時期對應指標均值與正常對照組的相對比值分別繪點于圖2和圖3中，得到相應的動態變化圖。從這些圖中可直觀看出HFRS病人在不同時期細胞免疫功能對應指標的變化。從中可分析：

　　　圖2　HFRS病人各期淋巴細胞免疫功能(Ea, Et以及PHA)動態變化與正常值比較

　　圖3　HFRS病人各期中性粒細胞免疫功能(趨化、吞噬及NBT還原)動態變化與正常值比較

　　1.HFRS患者早期Ea、Et、花環形成率及PHA皮膚反應均較正常人迅速下降，尤以PHA皮膚反應最為突出，Ea次之。圖2與圖3相比可明顯看出HFRS患者早期Lym受損程度較PMN更為顯著，且與病程密切相關〔6〕。張學軍〔7〕、王晶翼〔8〕等曾報道，HFRS病毒在體外能誘導正常人Lym產生化學發光，推測Lym表面存在HFRS病毒受體，Lym免疫功能受損可能是病毒的直接作用。本文結果進一步證實了這種推測。

　　2.HFRS患者PMN功能變化比較復雜（圖3），早期PMN趨化及吞噬功能有所下降，以后迅速上升至恢復期甚至略高于正常水平。而NBT還原功能則隨著病程的好轉反而下降到最低點。造成這種現象的原因尚不清楚，但可以證明，PMN在HFRS整個病程中起著不可忽視的作用。至于HFRS患者PMN與Lym細胞免疫功能之間有何內在聯系及它們在時相上有何關系，還需進一步研究。

　　3.圖2和圖3都顯示HFRS患者無論是Lym還是PMN功能在恢復期仍未能完全達到正常水平，說明HFRS患者細胞免疫功能的恢復還需一段時間，提示臨床治療應予以關注。

　　參考文獻

　　[1]于丹萍. 流行性出血熱發病機理的研究. 中華內科雜志, 1987, 26(8)∶ 482-484.