一小時DDA鑒定DIA定量4000個Hela蛋白（一）

引言

數據非依賴性的掃描模式（data-independent acquisition, DIA）是近幾年來發展的一種新的質譜數據采集方式^[1]。它的理念是用二級碎片離子進行蛋白相對/絕對定量。 DIA 掃描模式中，超高分辨質譜對特定質量范圍內的所有母離子進行碎裂，采集所有母離子的碎片離子，并快速地依次掃描相鄰的母離子寬口內的所有碎片離子。 DIA 的數據中包含了所有碎片離子的保留時間和強度信息。用非常小的質量偏差寬口（如 10 ppm）目標性地抽提同一肽段的多個子離子，計算子離子的強度，就能對該肽段進行鑒定和定量。 DIA 定量相比傳統的基于母離子強度的 DDA 定量有選擇性好，定量準確等優點^[1]，所以 DIA 成為定量蛋白組學新的發展方向。

Q Exactive HF 是賽默飛世爾科技在 2014 年的 ASMS 上推出的全新靜電場軌道阱超高分辨質譜儀（圖 1）^[2,3]。 Q Exactive HF 采用了分段式四極桿技術（Advanced Quadrupole Technology， AQT）使離子傳輸效率至少提高了 2 倍；超高場 Orbitrap 技術，提高了Orbitrap 掃描速度，在 15000 分辨率時，二級譜圖的掃描速度是20 Hz。這兩項技術提高了 QE HF 進行 DDA、 DIA 數據的采集能力。本文用 1 小時快速色譜梯度對 QE HF 的 DDA 鑒定能力和 DIA定量能力進行考察，同時從定量肽段數目和 CV 兩方面對 DDA 定量和 DIA 定量能力進行比較。

實驗條件

實驗材料和方法

Pierce HeLa Protein Digest Standard（貨號： 88329），稀釋至500 ng/μl， EASY-nLC 進樣 1μl， 500 ng進行 DDA、 DIA 數據采集，每種采集模式重復 3 遍。

高效液相色譜分離

高效液相色譜儀： EASY-nLC 1000 (Thermo Scientific^TM)
分析柱：實驗室自制 C18, 15 cm, ID 75 μm, 3 μm
流動相： A： 0.1% 甲酸水溶液； B： 0.1% 甲酸乙腈溶液
梯度： 60 min, 3/0 – 6/2 – 22/48 – 40/53 – 80/55 – 80/60（%B/min）
流速： 300 nL/min

質譜分析

DDA 數據采集：

質譜儀： Q Exactive HF (Thermo Scientific^TM)；
離子源： NanoFlex 離子源；離子模式：正離子；
噴霧電壓： 1.8 kV；毛細管溫度： 275° C； S-Lens RF： 55%；
分辨率：一級 120000@m/z 200，二級 15000@m/z 200；一級
AGC： 3e6， Maximum IT： 50ms；
碰撞能量： NCE 27%； Fixed first mass: 110 m/z

DIA數據采集：

質譜儀： Q Exactive HF (Thermo Scientific^TM)；
離子源： NanoFlex 離子源；離子模式：正離子；
噴霧電壓： 1.8 kV；毛細管溫度： 275℃； S-Lens RF： 55%；
目標 m/z 窗口： 400–1000； isolation window: 12Da；
碰撞能量： 27%； fixed first mass: 200 m/z； AGC target: 1e6；
Maximum ion injection time: atuo； loop count: 50

數據處理

Proteome Discoverer 蛋白鑒定流程：人蛋白數據庫（uniprot human_201309），母離子質量偏差: 10 ppm；碎片離子質量偏差： 0.02 Da；固定修飾：半胱氨酸烷基化（+57.021 Da）；動態修飾：甲硫氨酸氧化（+15.995 Da）；天冬酰胺和谷氨酰胺脫氨基化（+0.984 Da）；酶： trypsin；漏切位點： 2； FDR< 0.01

Skyline DDA、 DIA 蛋白定量流程： DDA 定量用 skyline MS1 filtering 功能，對每個肽段強度最高的 3 個母離子同位素峰進行抽提， idotp ≥ 0.8； DIA 定量用 skyline DIA 功能，設置隔離窗口 12 Da，對給個肽段強度最高的 5 個子離子進行峰抽提， mProphet 打分，控制 FDR < 0.01。

實驗結果

1. DIA 數據采集以及分析流程

圖 1. DDA 定量和 DIA 定量實驗流程

500 ng Hela 細胞裂解液進行 3 次 1 h 梯度 DDA 分析， Proteome Discoverer 1.4 數據庫檢索。將鑒定到的蛋白和肽段信息導入 skyline作為候選定量蛋白和肽段。基于母離子的定量用 skyline 中 MS1 filtering 功能對DDA 數據進行母離子強度抽提。 500 ng Hela 細胞裂解液進行 3 次目標 m/z 窗口 400–1000，隔離窗口 12 Da 的 DIA 分析。基于二級子離子的定量用 skyline DIA 功能對子離子進行峰抽提， mProphet 打分，篩選 Q value < 0.01 的肽段為定量肽段。

在分析 DIA 數據之前，需要建立譜圖庫，譜圖庫中包含所有蛋白在質譜中鑒定到的肽段，以及肽段的保留時間、碎片離子質荷比、碎片離子強度等信息。數據依賴性掃描是最好的建立譜圖庫的數據采集方式。 500 ng Hela 細胞裂解液進行三次DDA 數據采集。原始數據經 Proteome Discoverer 檢索并控制FDR < 1%。將三次 DDA 鑒定結果合并，導入 skyline 建立譜圖庫。 DDA 數據除了能給出蛋白和肽段的鑒定信息，還能基于母離子的強度/峰面積進行定量。 Skyline 中 MS1 filtering 功能對母離子的多個同位素峰進行抽提，并且根據同位素分布進行打分（idotp 值）^[4]。 Idotp 代表測定的同位分布和理論同位素分布的相似度。篩選 idotp 值大于 0.8 的母離子作為可信的定量肽段。

500 ng Hela 細胞裂解液用相同的色譜柱，相同的色譜梯度，將 QE HF 切換至 DIA 掃描模式進行 3 次 DIA 數據采集。在一次掃描循環中，目標母離子質核比范圍 400–1000，四極桿的隔離窗口為 12 Da，包含 50 次 MS/MS 掃描。每一張 MS/MS譜圖中包含了 12 Da 窗口內的所有母離子的碎片離子信息。 QEHF 使用了超高場的 Orbitrap，掃描速度是 20 Hz，所以每次循環所用的時間約為 2.4–3 s，與色譜兼容（圖 2）。 Skyline 處理DIA 數據時從譜圖庫中選取強度最高的多個碎片離子進行色譜峰抽提。