一種針對活細胞膜界面膜蛋白動力學測量的高精度方法

　　細胞膜既是保護細胞的重要屏障，也是細胞與外界物質和信息交換的界面。空間總厚度約為10納米的細胞膜（含突出于細胞膜兩側的膜蛋白結構）可被視為準二維凝聚相體系。磷脂雙層膜及鑲嵌于膜上的眾多蛋白質，整體上具有“多重界面復雜流體”的行為和特征。膜本身的二維流動性和三維起伏漲落為膜蛋白動力學的精密測量造成干擾。膜蛋白動力學的實時精密測量，是膜生物物理領域的具有挑戰的問題。近年來，為解決這一難題，中國科學院物理研究所SM4組發展出針對體外生物膜模型系統的單分子表面誘導熒光衰逝技術（SIFA）（Nature Communications 7: 12906, 2016）和脂質體包裹熒光悠逝測量技術（lipoFRET）（Angewandte Chemie International Edition 58: 5577, 2019），分別實現了固體表面支撐的二維脂雙層膜界面和三維脂質體雙層膜界面上的生物大分子跨膜動力學的高精度觀測，可直觀展現跨膜肽以及膜蛋白等在垂直生物膜方向上的動態過程，并由此獲取了相關生物大分子在跨膜過程中的關鍵動力學信息，為在分子層面揭示生物膜界面跨膜輸運的動力學機理奠定重要基礎。上述“干凈”的物理模型系統，未能有效應用于復雜的活細胞膜研究。活細胞中的生物界面體系組分更為復雜，蘊含著更加豐富且重要的生命過程。

　　近日，中國科學院物理研究所/北京凝聚態物理國家研究中心軟物質物理實驗室博士生侯文清、博士后馬東飛和賀小龍等在副研究員陸穎和研究員李明的指導下，以前序發展的高精度物理測量方法為基礎，發展了專門針對活細胞膜界面膜蛋白動力學測量的高精度方法，進而對其機理進行深入研究。該方法命名為細胞外環境填充熒光受體的熒光共振能量轉移（FRET with quenchers in extracellular environment，簡稱queenFRET）。該方法應用單點對多點的熒光分子間共振能量轉移（FRET）原理，通過測量熒光標記分子的熒光強度或熒光壽命，可精確觀察標記位點的插膜深度隨時間的變化。該方法以好于1納米（約等于細胞膜總厚度的十分之一）的精度探測細胞膜上單個膜蛋白的動力學。這是迄今為止檢測活細胞膜單個蛋白沿膜法線方向運動的最高精度。應用這一方法，可解決以往蛋白質與膜相互作用研究中的問題，包括膜蛋白的跨膜動力學、膜蛋白拓撲結構的動態轉變及細胞信號感知與響應等。

　　細胞膜結構極其復雜。細胞膜上生物大分子的動力學，有些是由其自身的特征和功能決定，有些是由與其相互作用的其他蛋白質決定。三項技術聯用，可以解決這個二選一的難題。例如，如果是前者，那么在活細胞膜上表現出來的動力學，亦可以在“干凈”的模型系統中觀察到。如果是后者，則只能在真實膜系統中觀察到。研究人員可以通過在模型系統中融合潛在相互作用對象的方式，找出決定該蛋白動力學性質的其他生物大分子。以上系列測量方法的優勢是無須改變生命科學實驗室普遍采用的商業熒光顯微鏡的結構和運行模式，便于推廣。對膜上的生物大分子進行熒光標記后，針對不同的研究對象，可采取不同的觀察策略。既可以用全內反射熒光顯微鏡又可以用共聚焦熒光壽命顯微鏡對目標進行有效觀察：基于全內反射熒光顯微鏡可以觀察貼壁細胞；基于共聚焦熒光壽命顯微鏡可以觀察不能貼壁的懸浮細胞。

　　相關研究成果以Subnanometer-precision measurements of transmembrane motions of biomolecules in plasma membranes using quenchers in extracellular environment為題，發表在Nano Letters上。侯文清、馬東飛和賀小龍為論文的共同第一作者，陸穎、李明為論文的共同通訊作者。研究工作得到科學技術部重點研發計劃、國家自然科學基金委員會、中科院前沿科學重點研究計劃和中科院青年創新促進會等的支持。

圖1.QueenFRET原理示意圖。熒光供體對細胞外填充熒光受體的能量轉移

圖2.基于全內反射顯微鏡的細胞膜內外磷脂分子分析

圖3.基于共聚焦熒光壽命顯微鏡的細胞膜內外磷脂分子分析