分子細胞卓越中心開發出活細胞DNA成像新工具

　　7月4日，《自然-方法》（Nature Methods）在線發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心陳玲玲研究組關于CRISPR-dCas12a應用于DNA活細胞標記的研究成果（CRISPR array-mediated imaging of non-repetitive and multiplex genomic loci in living cells）。該研究篩選并優化了現有的CRISPR-dCas12a系統，構建了可用于非重復序列DNA活細胞成像的CRISPRdelight系統；進而利用CRISPRdelight系統揭示了基因位點在細胞核內的定位與其運動能力和轉錄活性的相關性；利用RNA適配體修飾的CRISPR串聯序列實現了對4種衛星DNA的活細胞多色成像。

　　前期，陳玲玲研究組構建了基于CRISPR-dCas13的RNA標記系統，實現了對活細胞和斑馬魚胚胎內RNA的成像追蹤以及活細胞RNA多色成像。此外，研究發現，經過改造的靶向DNA的CRISPR-Cas9系統可用于活細胞DNA成像標記。這些CRISPR系統在標記內源核酸序列方面具有優勢，而對于非重復DNA/RNA序列的活細胞特異性成像卻存在較多限制。

　　CRISPR-Cas12a系統屬于類型V的CRISPR-Cas家族，在靶向DNA的同時具備將CRISPR串聯序列加工成多條成熟crRNA的能力。因此，CRISPR-Cas12a系統理論上可以通過CRISPR串聯序列在同一細胞內表達足夠數量的crRNA，從而實現對非重復序列DNA的標記。

　　為了驗證這一假設，該研究選取了三種已報道的能夠提高基因編輯效率的dLbCas12a突變體，并比較了它們在標記微衛星DNA Sat I和Sat III方面的能力。結果顯示，hyperdLbCas12a突變體可以實現更高的標記效率和信號質量。進一步，研究發現，hyperdLbCas12a可以加工CRISPR串聯序列，并維持與直接表達成熟crRNA近似的DNA標記能力。同時，該研究篩選出能夠表達長達50次crRNA重復序列的CAG啟動子，并基于此構建了用于活細胞DNA成像的CRISPRdelight系統。

　　該研究針對CCAT1轉錄起始位點上游10kb的區域設計了48條gRNA，使用CRISPRdelight系統實現了CCAT1基因位點的活細胞標記。以同樣的方式，CRISPRdelight系統在其他6個非重復序列基因位點均得到有效驗證。同時，該系統在HCT116、U2OS以及小鼠胚胎干細胞中同樣有效。研究發現，相較于之前報道的基于CRISPR-dCas9的CARGO活細胞標記系統，CRISPRdelight系統具有質粒構建成本低、周期短、可表達gRNA數量多、標記系統組成更簡潔等優點。

　　進一步，該研究利用CRISPRdelight系統分析了CCAT1在細胞核內的分布特點和運動特征。研究發現，位于細胞核膜處Lamin蛋白層的CCAT1位點運動能力弱于位于細胞核內的CCAT1位點；進而檢測CCAT1的內含子表達信號發現，Lamin蛋白層的CCAT1位點轉錄活性更弱。同時，研究對HSPH1、HSPA1A等熱休克基因進行標記，并在向細胞施加42°C或亞砷酸鈉刺激后發現，定位于核斑的HSPH1基因位點會增多，且位于核斑的基因位點轉錄活性會更強。這表明了基因組DNA的細胞核內空間位置與其運動能力和表達活性的相關性。

　　該工作通過RNA結構優化，將BoxB、Pepper、PP7和MS2等RNA適配子元件插入到gRNA中，利用CRISPRdelight系統和這些元件對應的融合熒光蛋白，實現了微衛星DNA Sat I、Sat II、Sat III和Sat α的活細胞四色標記。CRISPRdelight系統為探討活細胞中DNA位點的空間位置和動力學特征，提供了更簡單和便利的新手段。

　　研究工作得到國家自然科學基金委員會、科學技術部、中國科學院和上海市的資助，并獲得分子細胞卓越中心細胞分析技術平臺的技術支持。