上海交大朱建偉：自主創新是生物藥物研發的根本道路

　　生物類藥物發展現狀

　　自2000年以來，生物藥物市場平均每年以10%以上的增長率發展，這一趨勢將持續到2020年甚至到更長的時間。最近生物藥物市場最暢銷的前10種藥物中，大概有7~8個是生物類藥物，其中大部分是抗體藥物。由此可知，生物類藥物（抗體藥物）主導了藥物發展趨向。

　　從最近15年中國單抗藥物申報數量趨勢圖來看，從2000年到2010年，每年申報數量不超過5個，這一時期生物類藥物發展緩慢；從2010年起，申報數量急劇上升；2015年，申報數量達到40多個。單抗藥物僅僅是生物類藥物的一種，由此可知，近年來生物藥物蓬勃發展。

　　生物藥物研發與個性化醫療藥物

　　藥物分類

　　1)普通化學小分子藥物：臨床應用最多的一種藥物，如阿司匹林、青霉素、Taxol（抗腫瘤藥物）等；

　　2)單抗類藥物：如胰島素、白介素、抗體等；

　　3)病毒疫苗：如VLP、Polio等；

　　生物藥物創新研發關鍵技術

　　抗體類藥物：新靶點的尋找；免疫毒素（ADC）的研究；雙特異、多特異免疫雜合蛋白的研究；

　　細胞因子：白介素、融合蛋白、長效化細胞因子等藥物的發現；與受體共表達的細胞因子藥物；細胞因子本身作為佐劑的研發；

　　新型重組疫苗：新型抗原、新型佐劑的研發以及大規模生產；

　　生產技術：連續生產、生產過程質量控制以及一次性技術的應用。

　　個性化醫療藥物

　　對于不同的患者，特定疾病的發生機理可能不同，因此針對特定疾病的治療藥物并不是對每一個患有該疾病的患者都有效果。這可能導致同樣的疾病需要不同的藥物來治療，增加了藥物開發的多樣性。個性化醫療藥物的開發就是基于這樣的情況，來開發正確的藥物在正確的時間治療對應的疾病。

　　瞬時表達技術在生物藥物研發中的應用

　　蛋白藥物基因表達有兩種技術，瞬時表達技術與穩定表達技術。

　　瞬時表達技術可以加速藥物前體中有效藥物的篩選，從而加快了新藥物的開發。從資源、時間和產品質量方面看，瞬時表達技術都優化了藥物研發過程，該技術極大地縮短了蛋白藥物從臨床前到臨床階段的開發時間。

　　瞬時表達技術與穩定表達技術的異同點

　　1)工藝步驟差別較大：穩定表達技術步驟較多，從細胞株的選擇到克隆，再到穩定性鑒定，需要進行眾多復雜操作；瞬時表達技術簡單方便，僅僅只需要將DNA與細胞混合進行轉化即可；

　　2)時間不同：采用瞬時表達技術僅需1-2個月即可；穩定表達技術則需要1年甚至更長的時間。

　　3)最終產品差別不大：無論是采用瞬時表達技術還是穩定表達技術，藥物蛋白的產量、質量均基本沒有區別，最大的影響因素還在于細胞株的選擇。

　　相關研究文獻表明，無論是在規模上還是在表達量方面，瞬時表達技術已經都達到了臨床藥物研發的標準要求。

　　藥物篩選方法（以IGFBP7為例）

　　第一步，利用多種信號肽、啟動子以及增強子的不同組合設計蛋白表達調控序列，并通過檢測不同方案的5‘端UTR表達量，最終篩選出表達量效果最佳的方案。

　　如圖所示，M3方案相對較好

　　第二步，使用western blotting 以及RP-HPLC方法鑒定表達效果；

　　第三步，表達蛋白的純化，通常采用常規分離手段實現快速表達純化；

　　第四步，驗證藥品蛋白的活性、分子量、質量以及濃度等一系列的藥物臨床應用參數，以確保藥物的應用性。

　　CRISPR/Cas9技術的原理及應用

　　CRISPR/Cas9技術特點

　　重組效率高、簡單，并可進行敲除敲入等操作；

　　可以建立具有多重突變的動物模型，在動物體內治療遺傳疾病；

　　可在人類干細胞中進行突變，改正缺陷；

　　可修改人工精子的基因；

　　可在大動物豬中敲除某些基因；

　　在CHO細胞中敲除FUT8基因（糖基化基因），產物沒有Fucose，增加了攻擊癌癥細胞的腫瘤細胞毒性（ADCC）；

　　在CHO細胞中敲入基因，可在高表達位置進行定點表達；

　　CRISPR/Cas9技術藥物開發應用原理

　　使用CRISPR/Cas9技術敲除CHO細胞的FUT8基因（糖基化基因）后，在生產抗體藥物的過程中就可以去除Fucose，使細胞失去引導蛋白糖基化修飾的能力，從而加強了抗體藥物本身對于癌細胞的攻擊能力，但并不會改變抗體本身對于癌細胞的親和力。

　　除了敲除細胞基因外，利用CRISPR/Cas9技術還可以向細胞中定點敲入一些抗體表達相關基因，從而輔助藥物研發。

　　抗體產品的創新方法

　　第一代生物藥物的開發

　　1982-1990年，分子生物學以及雜交瘤技術的發展，產生了一系列初期抗體藥物，此期間的藥物大多為鼠源蛋白，例如Humulin等。

　　第二代生物藥物的開發

　　利用截短、人源化、點突變、融合技術、糖基化技術以及多聚化等多種新技術，通過改變藥物的免疫源性和藥代動力學特性、增強藥物對于靶細胞親和力、優化生產流程等方法改造第一代藥物，從而產生了第二代生物藥物。由于氨基酸的改變，第二代生物藥物半衰期增加，長效性增強，比如可以增強造血功能EPO，在增加2個糖基化氨基酸后，半衰期增加了3倍。

　　單克隆抗體：抗體中人源序列越多，親和性越高。第二代生物藥物基本由鼠源變為鼠人源嵌合體甚至完全轉變為人源抗體，實現了鼠源蛋白藥物向人源蛋白藥物的轉變，現在的單克隆抗體基本為人源化的抗體。TNF、EGF受體等新靶點的發現，擴大了新藥篩選的選擇。

　　抗體片段藥物：抗體片段本身可以作為藥物來開發，例如雷珠單抗。

　　雙特異性抗體：這類是對兩個抗原同時有親和力的抗體，現階段做整個分子抗體還存在困難，在工藝上很難完全達到輕重鏈構象正確折疊以及配對。Cell、PNAS等多種雜志都有相關報道，國際上雙特異性抗體是研究熱點。在臨床上，淋巴瘤、前列腺癌、胃腸道瘤等癌癥的藥物都在研發中。

　　提問環節

　　1、今年微生物組學又開始興起，用微生物表達藥物是否也會有一個比較大的利好，具體有哪些？

　　朱建偉院長：微生物作為表達抗體藥物的宿主這種方案是可行的。但由于微生物缺乏對蛋白分子糖基化修飾功能，所以還不能直接表達全抗體，但可以生產抗體片段。

　　2、用微生物或病毒表達腫瘤疫苗的可行性以及未來趨勢是？

　　朱建偉院長：長久以來，病毒一直被認為是危險品，連許多大公司都不愿意冒險來開發病毒疫苗。2013年，FDA才批準第一種病毒藥物上市。目前，病毒甚至微生物都正在被重視起來，不僅可以應用到腫瘤疫苗中，還可以應用到腫瘤的免疫治療中。

　　3、腫瘤疫苗是否存在大部分腫瘤都可以解決的途徑？

　　朱建偉院長：我認為是存在的，腫瘤疫苗有一部分引起的是體內的免疫反應，雖然目前機理還不是非常清楚，但是估計跟免疫治療的機理類似，由一點點的腫瘤疫苗來引起體內的免疫刺激反應，然后由體內的具有免疫功能的細胞來對腫瘤細胞進行殺傷。因此，是有可能存在一種腫瘤疫苗解決大部分腫瘤的途徑的。

　　4、目前對于雙特異性抗體研發來說，普遍性的技術問題是什么？

　　朱建偉院長：僅從生產工藝上來說，要生產全雙抗的技術是非常困難的，如果沒有特殊技術參與的話，只有12.5%的正確表達率，而加上許多Nature的文章中涉及到的新技術，最多也只能提高到70%-80%，還可能產生其他的一些問題。