不同植物SBPbox基因家族的比較分析

實驗概要

本研究利用生物信息學資源和工具，對雙子葉和單子葉模式生物擬南芥和水稻中的SBP-box基因家族進行了比較分析。利用兩個物種的SBP-box基因編碼的蛋白質序列構建了系統發生樹。在系統發生樹的末端節點上鑒定出12對旁系同源基因。利用非同義替換率與同義替換率(KalKs)分析了同源基因分離之后所經歷的環境選擇壓力。此外還搜索了EST數據庫以分析擬南芥和水稻中SBP-box基因的組織特異性表達。

實驗原理

SBP-box基因家族是植物特有的轉錄因子基因家族。這類基因編碼的蛋白質序列中包含一個高度保守的SBP結構域，并能夠特異結合在植物花分生組織識別基因SQUAMOSA及其同源基因的啟動子區段，以調控其表達。

實驗步驟

1. 擬南芥和水稻基因組中SBP-box基因的鑒定

在TAIR數據庫(http://www.arabidopsis.org)中獲得擬南芥中已知的SBP-box家族基因編碼的蛋白質序列。利用Pfam軟件預測這些蛋白質中包含的SBP結構域。再利用這些SBP結構域區段序列作為檢索序列，使用Blastp搜索TIGR擬南芥注釋數據庫(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/athl/)和TIGR水稻基因組注釋數據庫(http://rice.tigr.org/tdb/e2k1/osal/index.shtml。如果檢索到的蛋白質序列符合E ≤10^-10，將被作為候選蛋白質序列。再利用Pfam工具鑒定這些候選蛋白序列中是否包含SBP結構域。若存在SBP結構域，則認為其屬于SBP-box基因家族。新鑒定出的SBP蛋白質繼續作為檢索序列，檢索以上數據庫，直至沒有新的序列檢出為止。獲得這些SBP-box基因家族成員的基本信息之后，從TIGR數據庫中分別下載蛋白質、基因組和CDS序列。

2. 序列分析

SBP-box蛋白質的多序列聯配采用Clustal X 1.83，參數為默認。系統發生樹的構建也采用Clustal X 1.83，方法為Neighbor-joining，并采用bootstrapping分析評估所建立的系統發生樹。系統發生樹的顯示利用軟件Treeview 1.61。利用MEME程序(http：//meme.sdsc.edu/meme/intro.html)對擬南芥和水稻SBP-box基因家族成員鑒定保守性基序，除發現的最大基序數目為40外，其余參數為默認。為預測這些保守性基序的功能，對這些序列的一致性序列ScanPROSITE(http://expasy.org/tools/scanprosite/)檢索PROSITE數據庫中對應的功能性基序。

3. Ka和Ks的計算

從系統發生樹中推斷出擬南芥和水稻中旁系同源的SBP-box基因。旁系同源核苷酸序列的聯配采用蛋白質聯配作為向導，利用Clustal X 1.83軟件進行。手工去除聯配中的空位(gap)。利用K-estimator 6.1軟件計算旁系同源基因的Ka和Ks值。

4. 基于EST的表達分析

為鑒定擬南芥和水稻SBP-box基因對應的EST序列，利用Blasm檢索GenBank的EST數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/dbEST/，該檢索利用SBP-box基因的CDS序列作為檢索序列。取匹配率大于95，長度長于160bp并且閾值低于10^-10的EST序列作為SBP-box基因對應的EST序列。并對這些序列按照組織序列來源進行歸類。

5. SBP-box基因擴張模式分析

基因家族的擴張主要由三種方式，即大片段復制(segmental duplication)、串聯重復(tandem duplication)和逆轉錄轉座等隨機性插入和重復事件。串聯重復定義為出現在同一染色體區段的一個基因家族的基因。為驗證片段復制對擬南芥和水稻基因組中SBP-box基因家族擴張的作用，本研究采取了兩種方式對片段重復加以驗證。首先根據TIGR對擬南芥和水稻基因組的注釋結果，將所有的SBP-box基因定位于染色體上，并對比已經定義的染色體之間的片段重復(擬南芥基因組的片段復制：http：//www.tier.orb/tdb/e2k1/athl/Arabidopsis-genome duplication.shtml，水稻基因組的片段復制：http：//www.tigr.org/tdb/e2k1/osal/segmental dup/index.shtml)，查看SBP-box旁系同源基因對是否位于這樣的重復片段中。其次，在一對旁系同源的SBP-box基因的兩側各取10個編碼蛋白質的基因，通過Blast分析查看這兩個染色體片段中除這對SBP-box基因外是否還存在其它的同源基因，若還存在其它的同源基因，則表明這對旁系同源的SBP-box基因是由于片段復制的結果產生的。