方顯楊研究組與合作者共同開發了一種新型活細胞DNA成像技術

　　三維基因組互作與表觀遺傳修飾是基因表達調控的重要因素，其動態變化與細胞生長發育及癌癥等疾病的發生發展密切相關。解析染色質在活細胞內的時空動態，是理解基因調控機制的重要科學問題。現有基于CRISPR-Cas系統的成像方法可靶向內源基因序列，但仍受系統復雜性和靈敏度的限制，在非重復序列成像，多位點成像及原代細胞應用方面仍面臨挑戰。

　　2025年11月6日，方顯楊研究組與合作者在《Nature Biotechnology》期刊在線發表了題為"CRISPR live-cell imaging reveals chromatin dynamics and enhancer interactions at multiple non-repetitive loci"的研究論文。針對前述問題，研究團隊將CRISPR技術與拓展遺傳密碼技術結合，開發出一種新型活細胞DNA成像技術--CRISPR PRO-LiveFISH（Pooled gRNAs with Orthogonal bases LiveFISH）。該技術在此前的CRISPR LiveFISH方法的基礎上進行了系統性升級，首次引入擴展遺傳字母表中的正交非天然堿基對，實現了對sgRNA的位點特異性熒光標記，并結合對Cas9與sgRNA結構的理性設計，顯著提升了探針標記的靈敏度。

　　在將LiveFISH技術應用于非重復序列標記時，關鍵挑戰在于如何構建高質量的熒光修飾的gRNA探針庫。方顯楊研究組此前基于拓展遺傳密碼系統開發了一系列的RNA定點標記（包括熒光標記）技術（Chem. Sci. 2020, PNAS 2020, Nat. Commun.（2021, 2023, 2025））。PRO-LiveFISH技術通過整合DNA文庫與拓展遺傳密碼技術，采用體外轉錄與轉錄后修飾相結合的策略，成功實現了高通量、位點特異性標記的高效sgRNA探針庫的制備，進而實現了非重復DNA序列的高靈敏度活細胞成像，并適用于原代細胞。該技術可同時對多達6個不同基因位點進行多色動態觀測，并且僅需10條sgRNA即可在活細胞中有效標記非重復序列。在顯著簡化操作的同時，也可降低對內源基因結構和功能的潛在影響。

　　利用PRO-LiveFISH技術，研究團隊成功實現了活細胞內多基因位點的同步動態觀測，揭示了表觀修飾和染色質互作相關的動態調控規律。首先，通過比較不同細胞狀態（如小分子擾動）與不同細胞類型中同一基因位點的運動行為，發現染色質運動狀態與其表觀修飾水平密切相關：活躍的組蛋白修飾（如乙酰化）通常伴隨著相對受限的位點運動，而乙酰化水平下降位點運動則會相對增強。其次，通過對特定增強子及其靶基因進行同步動態標記，研究發現它們在動態運動中依然能保持持續的空間鄰近，提示增強子-啟動子互作具有較高的時空穩定性。最后，通過對超級增強子及其靶基因的追蹤顯示，轉錄共激活因子BRD4是維持此類三維互作的關鍵分子，當其功能被抑制時，此類互作便會顯著解離。這些發現從動態視角深化了對基因調控機制的理解。

　　綜上，通過結合擴展遺傳密碼技術與sgRNA理性設計，CRISPR PRO-LiveFISH技術為動態三維基因組研究提供了新的活細胞多色成像工具，適用于非重復DNA序列的動態標記以及原代細胞成像。借助該工具，研究團隊系統揭示了染色質動態與表觀遺傳之間的關聯規律、解析了增強子-啟動子（E-P）的時空互作特性，并闡釋了轉錄共激活因子BRD4在維持超級增強子三維互作中的關鍵作用，從而深化了對表觀調控和三維基因組時空動態調控機制的理解。

　　清華大學生命科學學院王海峰研究員、中國科學院生物物理研究所方顯楊研究員和清華大學生命科學學院頡偉教授是該論文的共同通訊作者。清華大學博士生劉美鑠、黃可韻和已畢業博士生張杰（現為生物物理所方顯楊組博士后）為論文共同第一作者。該研究受到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、中國科學院戰略性先導科技專項（B類）和北京市自然科學基金的支持。

　　文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-025-02887-3