專家見解|激素檢測的未來會是臨床質譜嗎？

　　文章來源：中華檢驗醫學雜志, 2024, 47(7): 717-721.

　　作者：郭瑋 李小英 蔣黎 吳衛甲 王傳新

　　摘 要

　　激素定量檢測的準確性一直備受臨床和檢驗專業人員關注。人體內大多數小分子激素存在濃度低、結構類似等特點，需高靈敏度、高特異度的檢測技術實現其準確定量。近20年來，液相色譜-串聯質譜技術因其獨特的靈敏度和特異度優勢逐漸從科研走向臨床檢驗，被認為是對傳統免疫學方法的有力補充，并在臨床疾病診療方面不斷取得重要成果。為深入探討質譜技術在激素定量檢測中的應用價值，中華檢驗醫學雜志特邀來自臨床內分泌學、檢驗醫學領域的專家，圍繞質譜技術在臨床激素檢測中的性能特征、面臨的挑戰及未來發展方向等總結其經驗和看法。專家們一致認為，質譜技術在激素檢測中的優勢已非常清晰，有效解決了臨床在內分泌疾病診療時的一些需求，但仍面臨著人才儲備不足、樣本檢測通量低、運營成本高且缺乏規范化管理等一系列挑戰。

　　臨床內分泌學科的發展與激素的檢測能力密切相關，精確定量檢測激素水平是內分泌學科發展的關鍵。人體內大部分激素水平非常低，且因缺少高靈敏度的檢測方法，因此臨床上主要通過激素的生物功能來確定體液中激素水平，而無法準確定量。1959年放射免疫法的發明，實現了對體液樣本中肽類激素的檢測，并快速應用于小分子激素檢測領域，使類固醇激素的定量檢測成為可能。

　　20世紀80—90年代，臨床和實驗室對激素檢測的需求日益增加，推動了檢驗方法自動化的變革，免疫學方法檢測應運而生，但其準確性仍受諸多因素影響，如易受蛋白結合、放射性物質非特異性結合、嗜異性抗體和自身抗體的干擾等。尤其是小分子激素，不僅在體內種類繁多、結構類似，且大多含量較低，容易產生交叉干擾。因此，液相色譜-串聯質譜技術（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）因其高特異度和高靈敏度的性能特點，從科研走向了臨床檢驗，促進了內分泌疾病實驗室診斷的發展，比如新生兒遺傳代謝病篩查、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤的診斷等。近幾年，質譜技術在蛋白質標志物、肽類激素的定量檢測方面也取得了突破性進展。

　　在此，中華檢驗醫學雜志邀請5位臨床及檢驗專家探討LC-MS/MS在激素檢測中的應用價值，并討論了目前我國在該領域內面對的挑戰以及對未來的展望。

　　議題一 

關于激素檢測，最關注的性能特征有哪些方面？

　　王傳新教授（山東大學第二醫院） 臨床質譜技術近年來在我國發展迅速，其具有高靈敏度和高特異度等優勢，可實現對生物樣本中含量較低的激素化合物的準確定量測定，這一方面解決了對應用免疫學方法檢測有難度的生物標志物的測定，另一方面也更有利于臨床發現并應用新的標志物，助力臨床醫學的發展，尤其在大型綜合醫院對臨床疑難病例的診斷與鑒別診斷需求較大，質譜技術可為臨床診療提供更好的服務。但目前醫院專業人才對質譜技術的系統學習和操作仍存在困難，這也是導致臨床質譜技術難以得到推廣使用的關鍵因素之一。同時，質譜設備目前價格普遍較高，如何在提高檢測效率的同時降低檢測成本，以及改進檢測方法也需進一步研究和完善。

　　李小英教授（復旦大學附屬中山醫院內分泌科） 作為一名臨床醫生，我非常認可質譜檢測技術，內分泌激素檢測在疾病診斷、治療監測、預后判斷等方面具有非常重要的作用。從放射免疫法到化學發光法，再到質譜檢測，這些檢測方法給臨床診斷帶來了很大幫助。在臨床方面，我們更關注以下幾點：第一，以患者利益為核心的檢測價值。除關注技術本身的性能特點，還需與臨床需求結合，例如質譜檢測的性價比。第二，認識的局限性。現階段大多數醫生即使了解質譜檢測可更準確地檢測低濃度激素，但對質譜的應用認識還停留在科研方面，除常規檢測項目外，質譜技術還需要進一步拓展使用空間。第三，檢測方法的規范性。質譜檢測如可實現試劑商品化，則該技術將會更好地被推廣應用。

　　郭瑋教授（復旦大學附屬中山醫院檢驗科） 激素檢測技術有以下幾點值得關注：首先，方法性能是否滿足臨床需求，臨床對腎上腺髓質激素（比如甲氧基腎上腺素類物質）有檢測需求，但自動化檢測設備靈敏度低，檢測不準確，而質譜技術可實現精準定量。第二，檢測項目的定量限，體內某些激素具有重要的生物學效能，但含量很低，因此對低濃度激素檢測的準確度和靈敏度尤為重要。例如對醛固酮的檢測，應用放射免疫法可檢測較高濃度（100~300 pg/ml）樣本，但由于方法學的限制，對低濃度樣本，無法準確定量檢測。第三，參考范圍的確定，實驗室可參考權威醫學檢驗機構應用或文獻報道的參考范圍，并經小樣本驗證通過后方可使用，有條件的實驗室可自行建立參考范圍。需注意的是激素生理水平受較多因素影響，包括性別、年齡、生理周期（如孕酮）、晝夜節律（如糖皮質激素）、體位（如鹽皮質激素）等，其參考范圍的建立和驗證均需根據不同情況進行分組，并需檢驗實驗室與臨床醫生緊密合作。

　　蔣黎教授（四川省人民醫院檢驗科） 人體內的激素水平在不同病理、生理狀態下差別較大，最低可達pg/ml級。此外，激素的中間代謝產物多，其分子組成和結構相似。因此檢測方法必須具有高靈敏度和特異度，才能對其進行精準定量檢測。目前廣泛應用于生物標志物檢測的化學發光標記的免疫學方法，雖具有全自動化和高通量的特點，但其靈敏度只能達到μg/ml級，且特異性易受中間代謝產物和自身抗體的影響，因此其分析性能不能滿足臨床需求。放射免疫學方法雖具有高靈敏度，但因同位素對環境和操作人員具有放射危害，已被淘汰。此外，放射免疫學方法也無法克服中間代謝產物和自身抗體的干擾。

　　吳衛甲教授（凱萊譜科技股份有限公司） 近20年來，我一直從事質譜檢驗的臨床工作。從實驗室質量管理的角度，檢驗報告的準確性是實驗室最為關注的問題。大型臨床質譜實驗室每天需發布上萬份檢驗報告，這對實驗室的質量管理水平要求更加嚴格，我們應用六西格瑪管理方法以實現檢驗報告出錯率最低的目標。在激素檢測方面，放射免疫技術、酶聯免疫吸附技術、化學發光法以及質譜檢測，都對臨床診斷的發展起到了非常重要的推動作用。檢驗服務于臨床，任何檢測方法都需提供準確測定值，為臨床診療提供幫助，即檢測報告需具備臨床有效性，這不僅要求實驗室在檢測激素時選擇靈敏度及特異度高的技術，還需具備完善的質量管理體系。

　　議題二 

LC-MS/MS的激素檢測與免疫學方法比較，具有哪些優點和局限性？

　　李小英教授 質譜技術在一些疾病比如腎上腺相關疾病診療中起到了不可替代的作用，與現有的免疫學檢測技術形成了良好的互補關系，但行業內對質譜的臨床應用和接受度有很多不同看法。目前化學發光檢測技術已非常成熟，質譜檢測替代化學發光法的可能性較小。但隨著質譜檢測技術自動化的提高，也可能在有競爭力的項目上替代化學發光法。質譜檢測只有實現了自動化，才可能在臨床上廣泛應用。質譜檢測的發展充滿機遇與挑戰，需行業內人員各方面的努力和探索。

　　郭瑋教授 質譜技術的優缺點較為明確，公認的優勢有高靈敏度、高特異度、可同時檢測多指標、可區分結構類似物以及同分異構體等，其不足之處包括需手動前處理、缺少標準化操作規范、方法開發驗證難度高、對技術人員要求高等。質譜技術是一把雙刃劍，一方面，質譜檢測具有開發靈活的特點，能及時滿足臨床需求。例如，對原發性醛固酮增多癥的分型診斷，我們在較短時間內開發了18-羥基皮質酮、18-羥基皮質醇、18-氧皮質醇的檢測方法，用于單側醛固酮腺瘤和特發性醛固酮增多癥的鑒別。另一方面，質譜檢測在規范化管理和實驗室間結果一致性上存在挑戰，質譜技術的臨床應用應與免疫學方法優勢互補。例如，檢測睪酮時，男性樣本濃度高且需報告周期快，應選擇免疫學方法，但女性或性腺功能低下患者的樣本則推薦使用質譜方法。對補充維生素D2的患者，免疫法檢測會導致結果偏低，對臨床評估患者治療效果產生偏差，因此需選擇質譜方法，其可區分25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3，并準確定量。綜上，面對不同的臨床需求，實驗室需選擇合適的檢測方法。

　　蔣黎教授 與免疫學方法比較，LC-MS/MS用于激素檢測具有明顯優勢，包括高靈敏度、高特異度、檢測濃度范圍廣，多指標聯檢等，可為臨床診療提供重要的實驗室依據。其中，多指標聯檢同時精準定量檢測多種激素及中間代謝產物，對內分泌疾病的診斷具有重要價值。例如，同一代謝通路中的類固醇激素及其中間代謝產物都屬于四環脂肪烴化合物，均具有一個環戊烷多氫菲母核，其生理作用的不同主要由其側鏈基團或空間結構的差異決定。免疫學檢測很難區分激素的組成和結構差異，存在交叉反應的干擾。利用LC-MS/MS檢測類固醇激素及其中間代謝產物，不僅能有效鑒別在組成和結構上非常相似的分子，而且能同時定量檢測代謝通路中上、下游關鍵代謝物，通過分析關聯的類固醇激素及其中間代謝產物水平，實現對腎上腺相關疾病的精準診斷和鑒別診斷。

　　然而，目前質譜技術應用于臨床實驗室的激素檢測還存在一些局限性，如激素檢測前處理流程繁瑣、手工操作步驟多、檢測通量低、儀器價格昂貴，此外仍缺乏標準化檢測程序，實驗室間結果一致性差，缺乏適宜的參考區間等。

　　議題三 

LC-MS/MS技術應用于臨床實驗室中的激素檢測存在哪些限制條件？

　　王傳新教授 質譜技術的臨床應用優勢已非常清晰，理論上，質譜方法應為小分子激素檢測的金標準。但操作標準化、收費標準和人才儲備是限制其應用普及的3個重要方面。首先是管理體系，由于現階段質譜檢測的自動化程度低、技術人員水平參差不齊，即使質譜技術具有高準確度，但如果沒有完善的管理體系支撐，則無法保證各實驗室間結果的一致性。若患者在不同醫院轉診，檢查項目重復開單，不僅造成資源浪費甚至加深醫患矛盾。其次是收費標準，質譜檢測設備成本較高，且需配置高水平的專業人員對質譜實驗室進行管理，這會造成醫院的整體運營成本較高，如果參考現有項目的收費標準，則可能導致科室虧損。最后是人才培養，目前檢驗的學科體系未設立針對質譜檢驗人才培養的課程，其與基因測序的生信分析相似，同屬于交叉學科，需專門人才培養實施方案。因此，人才短缺也是臨床質譜發展面臨的很大挑戰。

　　李小英教授 相比于檢測技術性能特征，臨床醫生更關心檢測結果是否與疾病的發生發展一致。質譜技術有很多優勢，但臨床醫生對其認可度不一。質譜檢測可同時報告多項指標結果，但多數臨床醫生對中間代謝物變化情況的解讀存在困難，檢驗人員不僅要做好檢驗工作，也應與臨床醫生進行多渠道、多維度的溝通。質譜檢測是一項很有發展前途的檢測技術，但仍存在一些短期內無法克服和解決的問題，未來質譜技術的發展如果能為臨床疾病的診斷、預后帶來更多幫助，則臨床對其需求會越來越多。我們可以期待臨床和檢驗工作者攜手共同推動質譜技術在臨床的應用。

　　郭瑋教授 質譜檢測與常規方法相比，有以下幾個方面的不同：首先，從分析前角度來說，質譜檢測自動化程度較低、設備價格較高、人員要求更高，這是限制質譜普及的重要因素。其次，從分析中角度，質譜檢測可靈活開發新的檢測方法，這為科學研究向臨床應用轉化提供了更多機會。最后，從分析后環節，所有質譜檢測的臨床報告均需專業技術人員審核以及必要時與臨床溝通，這促使檢驗與臨床人員要有更多的合作和探索。

　　蔣黎教授 目前，質譜激素檢測在臨床的普及和推廣存在以下3個限制條件：第一，臨床實驗室缺乏接受質譜相關專業培訓的高級技術人員，在質譜儀的日常運行和維護、方法學建立和性能評價方面均需加強管理。第二，缺乏針對質譜檢測專項技術項目的合理收費標準，公立醫院臨床實驗室以常規收費標準開展質譜檢測，存在成本虧損問題。第三，質譜檢測項目雖然研發速度快，但商品化試劑上市周期長，不能滿足臨床需求，亟待提升實驗室自建檢測能力。

　　吳衛甲教授 目前合理的收費標準是促進質譜技術在實驗室常規應用的重要因素。例如游離睪酮檢測，從臨床疾病診療角度，游離睪酮水平升高是診斷高雄激素血癥的最佳指標，目前質譜技術已實現準確定量檢測，在美國已應用于大型第三方實驗室，但其檢測成本相比于一些常規激素檢測方法高，另外一些其他質譜檢測項目（例如1，25-二羥維生素D、胰島素等）也存在同樣問題。現有條件下，合理、合規的質譜收費標準對于一些臨床剛需項目的開展會有極大的推動作用，也可更好地發揮質譜的臨床價值。

　　議題四 

LC-MS/MS分析多肽類激素的挑戰是什么？

　　郭瑋教授 目前臨床質譜檢測主要聚焦于小分子化合物的檢測與應用，對具有明確臨床應用價值的多肽類或蛋白質類大分子的檢測則需進一步研究與應用，例如甲狀腺球蛋白的檢測對甲狀腺癌患者術后效果和復發監測具有重要臨床價值，但自身抗體的存在會影響免疫學方法的檢測結果，因此采用質譜檢測是一種很好的解決方案，我們目前也正在做一些嘗試。

　　質譜檢測大分子化合物時涉及蛋白質酶切，因此受限于酶的選擇、批次差異、酶解效率等不確定性因素影響，LC-MS/MS檢測多肽類及蛋白質類的方法開發相較于小分子化合物難度更大，很難實現實驗室間結果的一致性。這是臨床實驗室目前面臨的痛點也是難點，也是未來技術發展過程中，我們需要共同探討的一個非常有價值的話題。

　　吳衛甲教授 多肽類激素由氨基酸通過肽鍵連接而成，最小的肽類激素可由3個氨基酸組成，如促甲狀腺激素釋放激素。多數肽類激素由十幾、幾十甚至幾百個氨基酸組成。一些分子量大的化合物（例如胰島素、類胰島素生長樣因子Ⅰ）超過LC-MS/MS的分析范圍，則可選擇高分辨質譜技術。對于濃度較低的蛋白或多肽，直接定量測定困難較大，多數應選擇抗體富集或去除干擾蛋白這兩種處理方法。對于酶切方法，除酶切效率、批次間的穩定性外，不同患者的個體差異也是影響結果準確性的因素之一。因此，需選擇3個特異性比較高的肽段確保檢測方法的特異性，但由于很難獲得商品化的標準品和內標物質，因此需與專業生產標準品和內標物質的廠商一起合作。最后，多肽類激素的檢測也存在基質效應，其檢測標準化的規范將比小分子檢測更具有挑戰。

　　蔣黎教授 目前，國內絕大多數臨床實驗室還處于建立和計劃建立小分子化合物的質譜檢測階段，而多肽和蛋白質的檢測，一般需要比三重四極桿質譜系統更高級別類型的質譜系統（例如超高分辨質譜），這對專業技術人才和設備資金的要求更高。然而，包括四川省人民醫院在內的一些大型醫療機構實驗室均在探索這類激素的質譜檢測方法，相信1~2年內這類質譜檢測項目將有望應用于臨床，服務于患者。

　　王傳新教授 總結各位專家的發言，我們可以感受到未來質譜檢測的臨床應用將不限于現有的開展項目。我們非常重視質譜技術，也深刻了解其在臨床的重要應用價值，我們要在臨床研究過程中逐步探索，不斷完善臨床質譜檢測的應用機制。目前，國內已有很多三甲醫院開展質譜檢測項目，但各實驗室檢驗能力參差不齊，需規范化管理。由于現階段各級醫院缺乏相關專業人才，將多肽類質譜檢測技術應用于中小型醫療機構可能會面臨諸多困難。但是我們相信，在諸多臨床、檢驗和產業界的專家學者共同努力下，我們將不斷積累經驗、攻克技術難關，逐步推進新技術的健康發展，為臨床提供更好的服務。