專訪張博：兩篇Nature子刊技術論文開創同源重組新方法

　　2011年在我們還不是十分熟悉它的名字的時候，它被評為了當年Nature Methods雜志的年度技術，2012年在這種技術已成功應用于人類體外培養細胞、酵母、線蟲、斑馬魚、植物、大小鼠等多個領域之后，它又入選了Science十大科學突破。這就是TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 技術。對于這種可謂是站在風頭浪尖的新型技術，國內學者也相繼展開了研究，然而在技術上能獲得進展的卻不多。

　　來自北京大學生命科學學院細胞增殖與分化教育部重點實驗室的張博教授研究組卻屢有斬獲：2011年在Nature Biotechnology雜志上首次利用TALEN在斑馬魚中成功實現可穩定遺傳的基因組定點突變;2013年又在此基礎上，發表Nature Methods文章，利用TALEN造成的DNA雙鏈斷裂，大大提高了同源重組效率，從而在模式生物斑馬魚中實現了真正意義上的同源重組基因打靶。

　　這兩篇具有重要意義的技術論文不僅拓展了TALEN技術的應用，而且令同源重組基因打靶擺脫了對胚胎干細胞(ES細胞)的依賴。為了更深入地了解這項最新技術成果的方方面面，生物通特聯系了張博教授，就讀者感興趣的問題請教了她。

　　同源重組效率至少提高幾十倍

　　關于同源重組，分子生物學等領域的讀者肯定不陌生，這是一種利用相似序列DNA重排機制的生物學技術，利用這種技術可以對基因組進行精確修飾，在研究基因功能，構建人類疾病的動物模型，遺傳育種等方面應用廣泛。

　　但是“傳統的同源重組方法主要是用于在小鼠ES細胞中進行基因打靶，通常只是通過轉染的方法提供DNA供體，主要依靠細胞內自發的同源重組事件。一般來說，在ES細胞中，自發同源重組的效率在百萬分之一的水平;當然，考慮到細胞的轉染效率，這個數值有一定的低估，但是不會有數量級上的差異。在注射小鼠受精卵的情況下，同源重組效率小于0.2%(Brinster等)”，Nature Methods文章的共同第一作者、張博教授研究組的佟向軍副教授解釋道，“在斑馬魚中同源重組的效率應該更低，因為在我們的實驗中，只注射重組載體(DNA供體)的胚胎幾乎檢測不到同源重組發生，因而無法像小鼠ES細胞那樣進行同源重組基因打靶。”

　　為此，張博教授研究組展開了深入探索，他們利用TALEN方法造成DNA雙鏈斷裂，大大提高了同源重組效率，從而在模式生物斑馬魚中實現了真正意義上的同源重組基因打靶。

　　張教授表示，“前人有工作表明，DNA雙鏈斷裂能夠提高同源重組的效率。我們的論文就是利用這一原理，通過TALEN提高同源重組的效率，以實現直接在動物個體水平篩選同源重組基因打靶的后代。在我們的實驗中，F0斑馬魚的種系傳遞的效率為1.5%(從275條F0中篩選到4條生殖細胞打靶成功的斑馬魚)，種系嵌合率平均為12%。不過，由于只注射重組載體時我們在斑馬魚胚胎中從未檢測到同源重組事件，因此難以計算同源重組的效率究竟提高了多少倍;根據現有的數據，預計應該至少提高了1~2個數量級(幾十倍)。”

　　而且除了提高重組效率外，這種方法還有以下優勢：

　　(1)能夠按照人們的意愿精確修飾/改造基因組；

　　(2)實現基因敲入(knock-in)和條件性基因敲除；

　　(3)精確制備模擬人類遺傳病的動物模型：很多人類的遺傳病是致病基因的錯義突變(missense)造成的，用同源重組的方法可以在斑馬魚中造成相對應的基因突變形式，從而在基因水平精確模擬人類疾病。

　　此外，跟短片段單鏈寡聚核苷酸造成的重組修復(Steven Ekker的方法，只能進行小范圍修飾)相比，用傳統的長雙鏈DNA做同源重組打靶載體至少有以下優點：

　　(1)能夠進行大片段的基因修飾，比如將報告基因(如GFP)整合到內源基因中，或模擬基因較大片段缺失引發的人類遺傳病(這種病也有很多)等等;

　　(2)容易檢測隨機插入(利用接頭介導的PCR或Southern雜交技術)，這對于條件性基因敲除尤其重要。因為loxP或FRT這樣的短序列插入非特異的位點，有可能引發意想不到的后果，使實驗結果難以解釋;

　　(3)由于可以進行大片段修飾，使人們有可能一次性插入兩個loxP位點，完成條件性基因敲除;短片段單鏈寡聚核苷酸的方法要分成兩步進行，需要兩次篩選，加上養殖時間，會耗費更多的精力、時間和空間。

　　承前啟后的技術成果

　　在采訪過程中，我們誤以為最近發表在Nature Methods的這項成果是首次利用TALEN在斑馬魚中成功實現可遺傳基因定點突變，然而其實早在2011年，張博教授就已經開始了這方面的研究。他們在此前的研究中，單獨采用一對TALEN，造成靶位點產生DNA雙鏈斷裂，利用細胞非重組末端連接(NHEJ)修復時產生核苷酸的小片段缺失和/或插入(indel)，從而實現基因的定點突變。

　　然而這種突變方式由于無法精確控制indel的類型，因此無法精確控制突變的結果(核苷酸序列)。為了克服這個問題，張教授研究組在最新這項研究中，額外加入了一個長雙鏈DNA，作為同源重組的供體(DNA序列模板)，這樣就可以通過同源重組的途徑，把目的基因精確改造成需要的形式了。

　　而且這些研究從理論上說可以適用于任意物種(包括經濟作物、大家畜、寵物、靈長類動物等等)以及任意物種的體外培養細胞(包括人類的體外培養細胞)。

　　張教授說，“這項技術除了能夠應用于生命科學基礎理論研究，應該還可以應用于所有依賴于精確修飾/改造基因組的工作，例如，構建精確模擬人類遺傳病的動物模型(用于研究病理和篩選藥物、評估毒理和藥效)，改良農作物、家禽家畜的經濟性狀和育種、保種方式，改造寵物的形態、行為等特征(使其更貼近人類的需求)，等等。對動植物本身擁有的內源基因進行遺傳改造，以獲取人類需要的性狀，從理論上說，這樣做應該比直接添加外源基因的轉基因動植物在安全性上更容意為大家所接受。而對于人類自身，這項技術跟干細胞技術相結合，有可能應用于基因治療領域，幫助人們修復受損傷的基因，或者破壞不需要的或有害的基因，從而根治某些遺傳病或預防某些疾病。”

　　更多展望……

　　關于基因組編輯技術，近期另外一項稱為CRISPR/Cas系統的方法也受到不少科學家的關注，為此我們也請教了張教授，她表示，“CRISPR/Cas 技術在實驗操作上確實比TALEN簡單，不過，將這項技術應用于基因打靶是兩個月前才剛剛被報道的，我們的工作則是在2011年就開始了。那時，TALEN是剛被報道的一種優于ZFN的、可以隨意改造的人工核酸內切酶。

　　CRISPR/Cas在基因打靶原理上跟TALEN類似，都是通過造成靶位點的雙鏈斷裂，誘導靶基因產生突變。也就是說，CRISPR/Cas跟 TALEN一樣，應該也可以提高同源重組的效率。或者說，我們這項技術所依據的理論完全適用于CRISPR/Cas技術;理論上，只要將一對TALEN換成Cas9和guide RNA的組合，應該同樣可以通過CRISPR/Cas技術實現對任意基因組進行精確修飾。也就是說，我們這項技術應該很容易轉化成基于CRISPR /Cas系統的基因組精確修飾/改造技術。”