中性粒細胞堿性磷酸酶染色（偶氮偶聯法）

1. 實驗原理

在PH9.2-9.8的緩沖溶液中，細胞中的堿性磷酸酶能將底物磷酸苯酚鈉水解，生成 α-苯酚和磷酸鈉，再以穩定的重氮鹽與酚偶聯成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞漿中。

2. 標本采集

2.1 病人準備：了解病人是否對局麻藥有過敏史，凝血因子嚴重缺陷引起的出血

性疾病，穿刺部位有炎癥或有畸形，晚期妊娠的婦女作骨穿時要慎重。

2.2 標本種類： 新鮮抽取的骨髓穿刺液。

2.3 標本采集要求：

2.3.1  高壓消毒的穿刺針，一次性無菌手套和抽取骨髓液的無菌注射器。

2.3.2  臨床上首選穿刺部位為髂后上棘，翻身困難，需多部位穿刺患者可選擇髂前上棘為穿刺部位。小于3歲的小兒還可選擇脛骨頭內側為穿刺部位。

3. 標本儲存：滴加95％ 乙醇蓋滿血膜10分鐘，水洗待干，室溫避光保存。

4. 標本運輸：室溫運輸。

5. 標本拒收的標準：溶血，稀釋標本不能作測定。

6. 試劑：

6.1 試劑名稱：中性粒細胞堿性磷酸酶染色試劑。

6.2 試劑生產廠家：上海太陽生物技術公司

6.3 試劑組成：

試劑1. 固定劑：甲醛10ml加甲醇90ml混合，2℃~8℃避光保存，有效期6個月。

試劑2. 貯存液：200mgα-磷酸苯酚鈉(AS-BI)溶于1mlN-N二甲基甲酰胺+200ml Tris-Hcl緩沖液，2℃~8℃避光保存。

試劑3. Tris-Hcl緩沖液，Tris 4.85g溶于200ml蒸餾水，加濃Hcl1滴~2滴，PH固定為9.1。

試劑4. 作用液：取貯存液2ml于溫水中30℃預熱5分鐘加堅固藍BB鹽2mg，混合。

試劑5. 中性紅溶液：2℃~8℃避光保存。

7. 操作步驟：

7.1 新鮮干燥涂片滴加固定劑作用2~5秒，水洗，待干。

7.2 滴加作用液室溫染色15~20分鐘，水洗，待干。

7.3 中性紅復染3分鐘，水洗，干后鏡檢。

8. 結果判斷：陽性反應，棕黑色顆粒定位于胞槳中。在油鏡下計數100個中性粒細胞，求出堿性磷酸酶陽性細胞百分比，并求出積分。

9. 臨床意義：NAP的積分，參考值為35-70分。

9.1 生理性變化：新生兒NAP活性增加，以后下降，成人較兒童活性減低，老年期更低。應激狀態如緊張，恐怖，激烈運動等NAP活性可增加。月經前期增高，行經后降低，經后期恢復。

9.2

病理性變化：

9.2.1 NAP積分增加：見于細菌性感染，再障，某些骨髓增殖性疾病(如慢粒，骨髓纖維結，真性紅細胞增多癥，原發性血小板增多癥)，慢粒加速期和急變期，急淋白血病，慢淋白血病，惡性淋巴瘤，骨髓轉移癌，腎上腺糖皮質激素及雄激素治療后。

9.2.2 NAP積分下降：慢性粒細胞白血病慢性期，陣發性睡眠性血紅蛋白尿，MDS，惡性組織細胞病。

10. 操作性能：快捷簡便，特異性強，靈敏度高。

11. 方法局限性：

11.1 標本應新鮮，且未受其它化學物品污染。

11.2 重氮鹽以堅固藍BB鹽為最佳，其次為B鹽。

11.3 堅固藍應適量，過多易致染色失敗，過少則反應較弱。

11.4 使用液配好后應立即使用(5分鐘內)。

11.5 應作陽性對照。