中科院Cell發表CRISPRCas研究新成果

　　來自中科院生物物理研究所的研究人員，在新研究中揭示出了CRISPR-Cas系統依賴于PAM獲取間隔序列(spacer)的結構基礎及機制。這項重要的研究工作在線發布于10月15日的《細胞》（Cell）雜志上。

　　論文的通訊作者是中科院生物物理研究所的王艷麗（Yanli Wang）研究員，其主要研究方向為RNA干擾相關蛋白的結構與功能研究。王艷麗研究組的王久宇（Jiuyu Wang）和李佳智（Jiazhi Li）為本文的共同第一作者。

　　CRISPR和Cas蛋白一起形成了一種微生物適應性免疫系統，保護細菌對抗入侵噬菌體和質粒。CRISPR是由一些長度為30-60個核苷酸的 “重復序列”（ repeat）組件構成,這些重復序列被長度變化為30-60個核苷酸的“間隔序列”(spacer)組件所間隔，間隔序列獲取自外源DNA。定位在第一個重復序列上游的富含A-T的前導序列(leader sequence)對于獲取間隔序列至關重要，并促進了CRISPR 序列轉錄。

　　CRISPR-Cas系統抵御來自噬菌體或質粒的入侵核酸分為三個步驟。首先，在間隔序列獲取階段，會從入侵DNA處獲得一個新間隔序列，整合到 CRISPR位點中。第二步，這一CRISPR位點會被轉錄加工為短成熟CRISPR RNA (crRNA)，crRNA隨后結合Cas形成一種蛋白質-RNA復合物。最終，蛋白質 -crRNA復合物會識別與降解與crRNA互補的入侵核酸。盡管當前已充分確定了表達及干擾階段的分子和功能機制，對于間隔序列的獲取階段仍有待詳細的分析。

　　Cas1和Cas2是唯一普遍保守存在于所有CRISPR-Cas系統中的兩個Cas蛋白。以往體外分析的結果表明Cas1是一種金屬依賴性的酶，能夠以一種序列非依賴性方式切割單鏈(ss) DNA、雙鏈(ds) DNA、十字形DNA及分支DNA。同樣，Cas2曾被確定為是一種金屬依賴性核糖核酸內切酶可切割ssRNA或dsDNA。但近期的一項研究證實 Cas2的“活性位點”并非獲取間隔序列的必要條件，表明Cas2可能發揮了其他未知的功能。

　　大腸桿菌Cas1和Cas2過表達可通過在第一個重復序列后插入33 nt外源DNA來誘導獲得新的間隔序列，表明Cas1和Cas2是獲得新間隔序列的必要及充分條件。以往的研究證實，Cas1和Cas2形成了一種穩定的復合物，發揮整合酶作用將新間隔序列插入到CRISPR位點中。在大腸桿菌中，這一整合過程涉及交錯切割第一個CRISPR重復序列，新的間隔序列被整合至前導序列附近。

　　為了了解獲取間隔序列的機制，在這篇Cell新文章中研究人員確定了大腸桿菌Cas1-Cas2結合雙叉DNA復合物的晶體結構。他們證實 Cas1-Cas2捕獲的前間隔序列DNA采納了一種雙叉形式，前間隔序列的3′overhang對于新間隔序列獲取至關重要。PAM互補序列(5′ -CTT-3′)定位在這一3′overhang內，Cas1a以一種序列特異性方式被識別并切割5′-CTT-3，分別在兩端的3’ overhang切割出5nt的長度，產生了一段33nt長度的DNA片段，通過一種剪切粘貼機制插入到CRISPR序列中。一旦前間隔序列結合，Cas1-Cas2會發生顯著的構象改變，生成一個有利于正確前間隔序列識別的平面。

　　新研究揭示出了有關PAM依賴性間隔序列獲取的重要結構機制。