Science：一種新的“miniCRISPR”在肌肉中展示了它的編輯能力

自從基因編輯策略CRISPR出現以來，它遇到了一個很大的限制：經典的CRISPR系統太笨重了，無法進入人體的許多組織并進行切片和切割。現在，加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna因幫助開發CRISPR而獲得2020年諾貝爾獎，她與人共同創立了一家公司，該公司的研究人員正在報告他們希望這將是向前邁出的重要一步。在最近發布的預印本中，該團隊描述了一種“mini-CRISPR”，它成功地植入了小鼠和猴子的肌肉細胞，在那里它有效地編輯了與神經肌肉疾病相關的基因。

在華盛頓大學（University of Washington）研究神經肌肉疾病基因編輯的Nic Bengtsson說，報道的內容“確實令人印象深刻”，他沒有參與這項工作。他說，這種由基因治療中常用的病毒攜帶到細胞中的微型基因編輯器，看起來很有希望成為一種“現成的系統，隨時可以用于”各種情況。不過，他警告說，在該策略在人體中進行測試之前，問題和障礙仍然存在。

CRISPR最初是作為細菌免疫系統的一部分在細菌中進化而來的，它類似于一套分子剪刀，可以在精確的位置切割DNA，允許它在一條RNA鏈的幫助下切除基因的問題部分，并將其引導到合適的位置。2023年12月，美國監管機構批準了首個基于crispr的治療方法，用于治療鐮狀細胞病。這種治療方法包括提取患者的血液干細胞，并在將其重新注入體內之前使用CRISPR對其進行修復。

將CRISPR的編輯機制直接送入血液的治療方法的臨床試驗正在進行中，它已經成功地編輯了肝細胞中的基因。但是，這種將CRISPR蛋白包裝成脂肪顆粒的方法尚未在其他組織中發揮作用，因為很少有脂質顆粒到達它們。相反，研究人員希望使用經過充分研究的腺相關病毒（AAV）來傳遞編碼CRISPR的DNA， AAV通常用于傳遞基因治療。然而，這樣做是具有挑戰性的，部分原因是CRISPR的組成部分體積龐大——尤其是切割DNA的Cas9酶，它通常包含1300多個氨基酸。在單個AAV中壓縮太多的DNA，因此研究人員嘗試使用兩個或更多AAV來傳遞CRISPR及其引導RNA。但到目前為止，它的效果并不好。

多個研究團隊一直在努力制作小型化的CRISPR系統，這種系統在編輯方面仍然有效，但可以被打包到一個AAV載體中。猛犸生物科學公司（Mammoth biosciences）的團隊就是其中之一，他們可能已經取得了成功。該公司的科學家們首先篩選了微生物中出現的各種CRISPR變種的基因序列數據。他們對最初的176名候選人進行了“一連串的測試”，并找到了“大海撈針”，公司首席科學官兼聯合創始人Lucas Harrington說，他曾是Doudna的學生。他們將這個最佳選擇命名為NanoCas；它有425個氨基酸，大約是Cas9長度的三分之一。Harrington和他的同事們對它進行了改造，使其能夠有效地切割哺乳動物的DNA。

這種縮小使得編輯系統的DNA能夠容納在單個AAV載體中。研究小組在實驗室中展示了NanoCas可以在各種哺乳動物細胞中編輯DNA，然后轉移到小鼠體內。當他們用它來關閉肝臟中稱為PCSK9的膽固醇基因時，NanoCas成功地編輯了大約60%的細胞，其表現至少與Cas9一樣好。

然后，他們轉向了傳統CRISPR更難對付的目標：肌肉。他們測試了NanoCas是否可以靶向肌肉細胞中的一種叫做肌營養不良蛋白的基因，這種基因編碼一種關鍵的支架蛋白。杜氏肌營養不良癥是一種毀滅性的肌肉萎縮疾病，通常在兒童早期出現，患有這種疾病的人在該基因上發生了突變，無法產生任何或足夠的功能性蛋白質。

在攜帶人類版本突變的肌營養不良蛋白基因的小鼠中，NanoCas策略似乎效果良好，編輯了包括心臟和小腿肌肉在內的一系列肌肉類型的10%至40%的細胞。（這些經過基因改造的老鼠不會像基因突變的人那樣生病，因此研究小組無法評估對杜氏癥狀的潛在影響。）

最后，在三只健康的獼猴身上進行了一項大型測試。研究人員將攜帶含有crispr的病毒載體DNA及其引導RNA的AAV注入動物的血液中。他們監測肝功能，因為肝損傷可能是AAV治療的風險；他們發現，這一指標和其他健康指標都在正常范圍內。根據肌肉類型，NanoCas編輯了多達30%的猴子骨骼肌細胞中的肌營養不良蛋白基因；心肌的比例稍低，約為15%。

基因治療專家、麻省大學陳曾熙醫學院（University of Massachusetts T.H. Chan School of Medicine）院長Terence Flotte說，這些水平“肯定在你期望的具有臨床意義的范圍內”。

但他和其他人指出，現在還為時尚早。目前還沒有關于這種策略是否能幫助生病的動物好轉的信息。AAV也有風險，包括免疫反應和潛在的“脫靶”效應，在這種情況下，健康的DNA會受到意外影響。“他們的初步數據令人鼓舞”，但“有限”，斯坦福大學基因治療師Mark Kay說。盡管如此，他還是為這種微型CRISPR能夠輕易地植入AAV載體而感到振奮，他指出，這開辟了大量新的組織靶點，包括杜氏癥——一種迫切需要新治療方法的疾病。

Harrington承認存在挑戰，包括對自動駕駛汽車的擔憂，但他對未來的發展充滿希望。他說：“事實上，我們現在可以非常有效地使用單個AAV進行編輯”，這使得將CRISPR植入體內并編輯以前無法進入的組織“不僅僅是理論上的”

Harrington說，Mammoth將繼續研究Duchenne，并將其NanoCas系統用于與其他肌肉疾病和腦部疾病相關的目標。“我們真的在努力思考，‘我們能盡快做些什么？’”