下述操作在該區進行:臨床標本的保存,核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。
要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染,所以應避免在本區內不必要的走動。可通過在本區內設立正壓條件避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染,加入待測核酸后,必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料,必須有明確的樣本處理和滅活程序。
用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔,實驗材料(原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等)如出現外濺,則必須分別處理并作出記錄。
對實驗臺適當的紫外照射(254nm波長,與工作臺面近距離)適合于滅活去污染。可移動紫外線管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。
樣本處理對核酸擴增有很大影響,必須使用有效的核酸提取方法,可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。
用于RNA擴增檢測的樣本制備好以后,應立即進行cDNA合成,因為cDNA鏈較RNA穩定,保存相對容易。為保證逆轉錄反應的需要,應在標本制備區設置一個以上的溫育裝置。
cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定,傾向于使用一步法:即使用在擴增反應緩沖液條件下具有逆轉錄活性的熱穩定的DNA聚合酶進行逆轉錄,其較cDNA合成后再開蓋以調節緩沖液或加入聚合酶進行擴增發生污染的可能性降低。
待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本制備區,不得在本區對樣本進行PCR擴增。