臨床FISH：為疾病治療帶來新視角

　　病理學家是形態學的支持者。對他們來說，組織切片上的點點顏色能幫助你區分良性和病變的組織，為治療提供線索。當然，關鍵詞是“染色”。組織切片在光學顯微鏡下是沒有特征的，因此病理學家（研究人員）必須染色，才能看見細胞。

　　在許多情況下，蘇木精和曙紅（H&E）染色就足夠了，這揭示了基本的組織結構。不過，有時人們需要更多的分子信息。此時，病理學家有兩個基本選擇。免疫組織化學（IHC），利用抗體對特定蛋白染色，顯示分子在整個組織中的分布；熒光原位雜交（FISH）利用核酸雜交來檢測特定序列，揭示染色體異常或病原體。

　　這兩種技術都不是新的。不過，這并不意味著研究人員和開發人員都已經滿意了。現在，讓我們來看看原位雜交的世界有什么新東西。

　　DNA FISH

　　FISH依賴標記探針的雜交來點亮特定的序列，如端粒或特定的基因。例如，研究人員可利用探針來識別通常分離的BCR和ABL基因，看看在哪些細胞中這兩個基因融合，這種情況可能發生在某些慢性粒細胞白血病的患者中1。帶有這個特定突變的患者能夠響應藥物imatinib（Gleevec，格列衛），因此檢測對決定療程是至關重要的。

　　一般來說，原位雜交的問題在于信號強度。每個細胞中只有相對較少的雜交事件，因此信號放大通常是必需的。一種簡單的方法是利用多個熒光基團重金標記探針序列。另外，研究人員也可以提高每個結合分子的信號。

　　比如，賽默飛世爾科技的酪胺信號放大（TSA?）過程就依賴一種名為酪胺的HRP底物，它與熒光基團（如Alexa Fluor? 488）偶聯。據這家公司細胞分析的產品經理Kamram Jamil介紹，將酪胺與HRP結合的二抗共同孵育，在每個抗體位點就產生了數百個熒光分子，形成了急劇放大的信號。

　　據Jamil介紹，他們將發布一個新版本的試劑 – SuperBoost。這種試劑將包括3個改進：流程簡化；每個抗體包含三個HRP分子，進一步放大信號；HRP終止液，將讓研究人員能夠開展多重反應，形成更加清晰的圖像。“我們有一些細胞數據，表明這種技術相當靈敏，”他說。

　　CRISPR FISH

　　盡管原理十分簡單，但FISH操作還是蠻費力的，對樣品也是蠻殘酷的。霍華德?休斯醫學研究所的項目科學家Timothée Lionnet表示，為了讓DNA雜交，樣品必須在高溫下變性。雜交步驟本身需要幾個小時甚至過夜。

　　Lionnet最近在PNAS上介紹了另一種策略，克服了這些困難2。他利用時下流行的基因組編輯技術，開發出CASFISH。這種技術依賴Cas9核酸酶的酶失活形式，并與Promega的HaloTag蛋白相結合。HaloTag是一種酶，可以讓氯化烷烴底物與目的蛋白共價偶聯，從而為標記蛋白提供了一種機制。

　　在CASFISH的操作中，gRNA指導Cas9蛋白與一些基因組位點結合，如端粒、中心粒或特定基因位點，從而取代了傳統的雜交步驟。這個過程只需15分鐘，在理論上與活細胞兼容。“操作更加溫和，也更快，”他說。此外，由于HaloTag兼容廣泛的熒光基團，這種操作可多重開展3。CASFISH載體可通過Addgene獲得。

　　RNA ISH

　　當然，原位雜交并不需要局限于DNA分析。盡管在臨床上尚未廣泛使用，但基于RNA的原位雜交（RNA ISH）在某些臨床問題上具有一些優勢。據Affymetrix腫瘤學產品營銷總監Guy Afseth介紹，這些優勢包括能檢測非編碼轉錄本、特定的剪接變體、分泌蛋白的mRNA表達，以及一些無抗體可用的生物標志物。

　　例如，白蛋白（albumin）是一個很有用的生物標志物，可區分原發性肝臟腫瘤和轉移瘤。Afseth表示：“如果你的腫瘤產生白蛋白，那么它是肝臟來源的；反之亦然。”不過他指出，白蛋白很難通過IHC來評估，因為它是一個分泌蛋白。為此，Affymetrix開發出一種特異的試劑，能夠在RNA水平定量白蛋白的表達。

　　另一個應用是某些頭頸部腫瘤中人乳頭瘤病毒（HPV）的檢測。Advanced Cell Diagnostics（ACD）的首席醫療官Rob Monroe表示，高危型HPV陽性的腫瘤預后較好，因此鑒定這些口咽癌中的HPV，可告知患者預后并制定治療方案。這家公司推出了RNAscope RNA ISH檢測。

　　對于頭頸部癌癥的HPV檢測，目前主要依賴IHC檢測替代的生物標志物p16，或通過DNA FISH分析來評估染色體整合和HPV基因組的亞型。Monroe表示，前一種方法不夠特異，而后一種又不太靈敏。“RNAscope檢測的好處是它的靈敏度高于DNA FISH，并且是高度特異的。”

　　ACD的RNAscope和Affymetrix的ViewRNA檢測都依賴所謂的分支DNA（branched DNA）。兩個或更多相鄰探針的結合創建了一個支架，其上可發生信號放大的過程，ViewRNA就高達96,000倍。據Afseth介紹，這種策略甚至適合FFPE樣品的片段化RNA，因為少數結合事件即可觀察到。

　　目前，Affymetrix和ACD都表示，他們正與Leica Biosystems合作，以便在Leica的BOND-III臨床實驗室染色系統上實現自動化的RNA ISH操作。“這對臨床診斷實驗室而言是向前邁進了一大步，”Monroe談道。