乙醇沉淀法純化放射性標記的寡核苷酸實驗

乙酸銨 乙醇 TE 放射性標記的寡核苷酸 純化的原料

材料

溶液和緩沖液
稀釋貯存液至適當濃度。

乙酸銨（1mol/L)

乙醇

TE(pH7.6)

核酸和寡核苷酸

放射性標記的寡核苷酸

純化的原料是方案 2(步驟 3 或步驟 5) 的反應混合液，T4 噬菌體多核苷酸激酶巳在 68°C 加熱后滅活。

方法

1. 放射性標記的寡核苷酸的管中加入 40ul 水，充分混勻，再加入 240ul 5mol/L 的乙酸銨溶液。再次混勻后，加入用冰預冷的乙醇 750ul, 混勻，于 0°C 放置 30 min。
用乙酸銨代替乙酸鈉以確保更有效地除去未摻入的核糖核酸。核糖核酸與脫氧核糖核酸在乙醇乙酸銨溶液中的溶解常數大于乙醇乙酸鈉溶液。未摻入的核糖核酸在沉淀反應中被保留在乙醇相。

2.4°C 下以最大轉速離心 20 min, 回收放射性標記的寡核苷酸。

3. 用裝有一次性吸頭的微量移液器小心吸去管中的上清。
警惕：上淸中含有大部分未摻入的 [γ-³²P]ATP。磷酸化反應常使用大于 100uCi 的放射性標記 ATP, 因此上淸中放射性劑量相當可觀，應小心、謹慎處理未摻入的放射性物質、移液器吸頭及微量離心管。

4. 在管中加入 500ul80% 的乙醇，彈動管壁以洗滌核酸沉淀，再次在最大轉速下離心 5 min。

5. 用裝有一次性吸頭的微量移液器小心吸去管中的上清（此時上清中仍含有相當剤量的放射性）。將離心管放置于聚異丁烯酸樹脂防護屏后，打開管蓋，讓剩余的乙醇揮發干凈。

6.100ulTE(pH7.6) 溶解放射性標記的寡梭苷酸。
放射性標記的寡核苷酸在-20°C 可以保存數天。但是，保存期延長時，³²P 的衰變引起的放射化學損傷會導致寡核苷酸與把序列的結合能力下降。