乳腺上皮細胞分離培養操作步驟和注意事項

乳腺主要由腺上皮組成，早期乳汁或斷奶后的乳汁含有上皮細胞團塊，可用離心法收集上皮細胞（混雜有巨噬細胞），培養時常用人胚小腸纖維細胞作飼養層，可抑制間質細胞生長。使用優化培養基可使用上皮細胞傳代，并形成克隆，在膠原底物上要形成三維立體的復層結構。胰島素，氫化可的松，霍亂腸毒素，EGF可促進上皮細胞生長。體外培養中，乳腺上皮細胞具有乳腺細胞的功能，可用于確定免疫標記物類型，這些細胞可被SV40病毒轉化，可用于研究正常乳腺細胞與乳腺癌細胞的區別，還是研究癌基因引起細胞轉化的重要材料。

1、操作步驟

①取材。于產后2～7天在病房收集乳汁，用無菌水擦洗乳頭，用手壓乳房使乳汁流入無菌容器，每人可收集10～20ml乳汁，以1：1的比例與培養基混合，以利離心。

②以1000～1500r/min 離心20min，仔細去除上清。

③用培養基將細胞清洗2～4次，直至上清液不渾濁為止。

④將離心洗滌的細胞沉淀，用培養基3～5ml制成細胞懸液，接種培養瓶（平皿或板）中于37℃，5%CO2下培養。

⑤3～5天更換培養基，換液2次后大約6～8天可見克隆形成，并且擴大，開始可見有滋養作用的巨噬細胞，以后逐漸消夫（培養基最好是無血清MCDB170，也可用含牛血清，胰島素，氫化可的松等的Eagle培養基）。

⑥待細胞長滿后，用0.2%胰蛋白酶消化5～10min，洗去消化液，以1：3比例分瓶僻傳代培養。

2、用乳腺細胞培養上皮細胞時需注意事項

①盡可能去除脂肪組織，用無鈣，鎂離子的PBS清洗（200U/ml青霉素，200ug/ml鏈霉素）3～5次，將組織剪成碎塊，移入離心管，用吹管吸打分散，靜置3～5min，使乳腺細胞及細胞團塊沉積管底，脂肪，纖維等碎塊懸浮上層，吸除上層液，補加洗液重復3～5次，最后用培養基重懸細胞，用3～4層無菌紗布過濾，調整細胞密度后分瓶培養。

②如果標本中纖維組織較多，可用膠原酶消化法獲取細胞。

③開始有巨噬細胞存在，可作滋養細胞，隨著上皮細胞的生長和克隆形成，巨噬細胞逐漸消失。

④培養時可用經照射或用絲裂霉素C處理過的3T3細胞作飼養層細胞。也可用膠原層，既利于上皮細胞生長，又利于從底層分離。

⑤培養基中也可加刺激生長因子如EGF，胰島素，氫化可的松，豬促乳素和前列腺素E1等，有利于細胞生長繁殖。