二代測序的焦磷酸測序，合成法測序，連接法測序和離子半導體測序原理

　　不同的二代測序平臺的區別主要體現在測序反應的技術上，這些差別可以分為4類：

　　焦磷酸測序，合成法測序，連接法測序和離子半導體測序。

焦磷酸測序

　　在焦磷酸測序中，測序反應通過每個核苷酸結合過程中釋放的焦磷酸來調控。釋放的焦磷酸參與了一系列化學反應從而導致鏈光的產生。發出的光由記錄基因蔟相應序列的相機來檢測。測序反應開始后，先一次孵育一個堿基，測量光發射情況（如果有的話），在降解未參與反應的堿基，最后加入另一個堿基。這項技術能夠產生較大的讀取長度，已經可以與Sanger測序法得到的讀取長度相比較。然而，高昂的試劑花費，和有6個或以上的均聚物會產生的高錯誤率阻礙了這個技術的應用。

合成法測序

　　合成測序法是使用可逆熒光和終止核苷酸的分步整合的方法進行DNA測序，并已被ll lumina NGS平臺使用。首先在測序芯片中同時加入四種核苷酸，核苷酸結合之后，剩余的DNA堿基就會被洗滌去除。每個基因蔟中熒光信號被讀取和記錄之后，這個過程一直重復直到測序反應完成。這個系統能通過一次只結合一個核苷酸來克服焦磷酸測序的缺點。然而，當測序反應進行時，儀器的錯誤率也在增加。這是因為去除不完全的熒光信號會導致更高的背景噪聲。

連接測序法

　　連接測序法與其他兩種方法不同，因為他不用DNA聚合酶來結合核苷酸，而是用16種8-mer Oligo核苷酸探針，在相互連接的5端，每個探針都吸附了四種熒光染料其中的一種。每8-mer包含兩個探針特異堿基，和6個退化堿基。測序反應開始時，引物先結合到適配序列上，再和相應探針結合。這個探針的結合時在退火條件下由兩個探針特異堿基引導，再由DNA連接酶連接到引物序列上。未結合的oligo核苷酸被洗去后，熒光信號就開始檢測會記錄。在這之后，切割掉熒光信號和8-mer探針的最后3個堿基，就可以開始下一個循環了。在大約7個循環的連接之后，DNA會變性，而另一個測序引物，在前一個引物的下一個堿基后開始重復這些步驟，總共用5個測序引物。這項技術的主要缺點就是產生的測序片段特別短。

離子半導體測序

　　離子半導體測序法時在測序反應種通過釋放氫離子來檢測一個基因蔟的序列。每個基因蔟直接定位在一個半導體三極管上，這個半導體三極管可以檢測溶液的ph值。在核苷酸結合過程中，一個氫離子被釋放到溶液中并會被半導體三極管檢測到。這個測序反應的進行過程和焦磷酸法類似，但是花費只是他的幾分之一。