二氫硫辛酰胺乙酰基轉移酶實驗

酶樣品

Tris-HCl CoA 乙酰磷酸 磷酸轉乙酰酶 DL-二氫硫辛酰胺

分光光度計

實驗所需「試劑」具體見「其他」

0.98 ml 實驗混合物

0.02 ml 酶樣品

30℃ 時，于 240 nm 處吸收值發生變化，需使用石英比色皿。

試劑

0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.6

0.01 mol/L CoA（游離酸，Mr＝767.5，CoA·Li₃，Mr＝785.4；23 mg 溶于 3 ml 水中）

1.0 mol/L 乙酰磷酸（LiK 鹽，Mr＝184.1；1.84 g 溶于 10 ml 水中）

磷酸轉乙酰酶（乙酰-CoA：正磷酸轉乙酰酶，4000U/ml）

0.2 mol/L DL-二氫硫辛酰胺（50 mg 溶于 1.25 ml 乙醇）。氧化型 DL-硫辛酰胺是可以購買到的（DL-6，8-硫辛酰胺，Mr＝205.3），還原反應可以在 Reed 等（1958）的方法下進行。0℃ 時，2 g DL-硫辛酰胺懸浮于 40 ml 乙醇和 10 ml H₂O 中。在 2 h 內連續地緩慢加入 2 g NaBH₄，溶液必須呈無色，如果必要的話可多加一些 NaBH₄。用 5 mol/L HCl 使溶液酸化，并且試劑是用 20 ml 三氯甲烷提取三次得到的。結合三氯甲烷的相用水洗三次，然后真空干燥。干燥的粉末溶于 5 ml 的熱苯（或甲苯）中逐滴加人石油醚，直到出現了穩定的渾濁。在冷室中過夜，就可以形成晶體了。再結晶過程應該重復兩次，終產物必須呈白色。