五花八門的DNA甲基化檢測（下）

　　近年來涌現出不少DNA甲基化的檢測技術，少說也有十幾種。大致可以分為兩類：特異位點的甲基化檢測和全基因組的甲基化分析，后者也稱為甲基化圖譜分析(methylation profiling)。下面生物通給大家介紹一些常用的方法。

　　全基因組的甲基化分析

　　基于芯片的甲基化圖譜分析

　　就甲基化圖譜分析而言，目前流行的分析方法是芯片。多個公司都提供了這種工具，包括安捷倫的Human CpG Island Microarray Kit，Illumina的HumanMethylation27 DNA analysis BeadChip，Roche NimbleGen的Human DNA Meth 2.1M Deluxe Promoter Array和Affymetrix的seven-array GeneChip? Human Tiling 2.0R Array Set。

　　平臺不同，過程也各異。安捷倫和NimbleGen的分析過程中，基因組DNA分成兩份，一份用來做 MeDIP，另一份作為對照。兩個樣品都標記熒光(富集的樣品用Cy5標記，對照用Cy3標記)，然后與芯片雜交。芯片上每個探針的Cy5/Cy3強度比例顯示出該區域的甲基化程度。

　　安捷倫的244,000-element array覆蓋了27000多個人CpG島和甲基化不足區域(UMR)。NimbleGen的Human 2.1M Deluxe Promoter array也覆蓋了27000多個CpG島，還包括了27000多個啟動子區域，所有這些都是以100 bp的分辨率。然而這兩個平臺都不能以單核苷酸的分辨率報告甲基化狀態，但是Illumina的Infinium和GoldenGate分析做得到。

　　Illumina的Infinium HumanMethylation27 BeadChip芯片覆蓋27,578個CpG位點。分析利用兩個位點特異的探針拷問這些化學上差異的位點，一個探針是為甲基化位點(M磁珠類型)設計的，而另一個是為未甲基化位點(U磁珠類型)設計的。探針的單堿基延伸摻入了一個標記的ddNTP，它隨后被熒光試劑染色。通過計算甲基化與未甲基化位點的熒光信號比例，可確定拷問位點的甲基化水平。

　　此產品雖評價頗高，可惜目前已停產，取而代之的是Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片。它以單堿基分辨率覆蓋了每個樣品中超過45萬個甲基化位點，實現了基因區域和CpG島的全面覆蓋。此外，還附加了甲基化專家所精選的高價值內容，包括CpG島之外的CpG位點，在人類干細胞中鑒定出的非CpG甲基化位點，以及腫瘤和正常組織中差異表達的甲基化位點等等。它的高覆蓋度、高通量以及低價格，讓它成為篩選GWAS群體的理想選擇。索取HumanMethylation450 BeadChip芯片的更多資料

　　相比之下，VeraCode GoldenGate甲基化分析更適合高通量的驗證研究，它以溶液的形式分析48至384個用戶指定的CpG位點。首先，將亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA 與分析oligo混合，oligo與未甲基化位點的U互補，或者與甲基化位點的C互補。雜交之后，引物延伸，并連接上位點特異的oligo來產生通用 PCR的模板。最后，用標記的PCR引物生成可檢測的產物。據Illumina的產品專家介紹，其產品的最大優勢在于單個CpG位點的分辨率。其它分析將甲基化定位在一段區域，而通過Illumina分析，你能精確測定某個CpG位點的甲基化水平。索取GoldenGate甲基化分析的更多資料

　　高通量測序

　　新一代測序儀的飛速發展，使得測序成本大幅度下降，也使得甲基化組(methylome)的研究成為可能。近兩年，多個研究小組將傳統的甲基化工具(如DNA的亞硫酸氫鹽轉化)與目標基因組捕獲技術和高通量測序相結合，繪制出了多張甲基化圖譜。

　　而第三代測序技術的出現，更是讓甲基化的直接測定成為可能。一年前，美國Pacific Biosciences公司利用獨有的單分子實時(SMRT)測序技術，直接測定了DNA的甲基化。這項成果發表在《Nature Methods》雜志上。

　　SMRT技術采用的是對DNA聚合酶的工作狀態進行實時監測的方法。DNA聚合酶催化熒光標記的核苷酸摻入到互補的核酸鏈中。核苷酸的摻入被檢測成熒光脈沖，依據其顏色鑒定出核苷酸。當聚合酶切斷連接在核苷酸末端的熒光基團時，脈沖終止。熒光脈沖的到達時間和持續時間產生了關于聚合酶動力學的信息，從而允許直接檢測DNA模板鏈中的修飾核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。

　　研究人員使用這些動力學特征，鑒定出基因組樣品中的腺嘌呤甲基化，并發現再結合circular consensus sequencing，他們能夠在單堿基分辨率上鑒定出表觀遺傳學修飾(mA、mC和hmC)。

　　飛行質譜

　　美國Sequenom公司的MassARRAY? 平臺也可用于DNA甲基化分析。MassARRAY? EpiTYPER? DNA 甲基化分析技術結合了堿基特異性酶切反應和 MALDI-TOF 檢測原理，可實現多重CpG的分析檢測。

　　堿基特異性酶切(MassCLEAVE)實驗由亞硫酸氫鹽處理待測 DNA 開始。經過亞硫酸氫鹽處理，DNA中未甲基化的胞嘧啶 (C) 轉變為尿嘧啶(U)，由此在DNA模板中產生甲基化特異的序列變化。利用 5' 末端帶有T7-啟動子的引物進行 PCR 擴增，產物經 SAP (蝦堿性磷酸酶)處理后用于堿基特異性的酶切反應。酶切后DNA片段的大小和分子量取決于亞硫酸鹽處理后的堿基變化，飛行質譜能測出每個片段的分子量，配套軟件 EpiTYPER 則能自動報告每個相應片段的甲基化程度。

　　MassARRAY甲基化檢測無需任何熒光標記，每個反應覆蓋長達500 bp的多個CpG位點，且靈敏度高，可檢測低至5%的甲基化水平。目前有多家公司提供MassARRAY甲基化檢測服務，如北京毅新興業。點擊了解更多信息

　　此外，科學家們也開發出一系列的技術和工具，在全基因組范圍定位DNA甲基化，生物通將在后文中繼續報道，敬請留意。