人外周血白細胞DNA制備

實驗概要

本實驗從人外周血中制備了白細胞DNA，介紹了制備基本原理及操作步驟。

實驗原理

從全血制備白細胞DNA，可用非離子去污劑Triton   X-100直接破裂血中紅細胞和白細胞的細胞膜，釋出血紅蛋白及細胞核，在反應體系中含一定濃度蔗糖，維護核膜內外的滲透壓，以防止核膜破裂，通過離心等手段即可獲得白細胞的細胞核。向核懸液中加入SDS破壞核膜，并使DNA從核蛋白中解離，經蛋白酶K，酚/氯仿抽提等常規制備DNA程序，即可獲得白細胞DNA。Triton  X-100直接法，操作簡便，經濟，DNA得率高，可用于臨床。

主要試劑

1. 溶液Ⅰ(pH7.6)：0.32mol/L蔗糖；5mmol/L MgCl₂；1％Triton X-100；0.01mol/L Tris-HCl (pH7.6)。

2. 溶液Ⅱ：75mmol/L NaCl；24mmol/L EDTA Na₂ (pH8.0)。

3. 10％SDS

4. 蛋白酶K：20mg/ml，-20℃貯存。

5. 1×TE (pH8.0)：10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)；1mmol/L EDTA-Na₂ (pH8.0)。

6. 0.9％NaCl

7. TE飽和重蒸酚(pH8.0)

8. 氯仿/異戊醇混合液(24：1V/V)

9. 10mol/L NH₄AC

10. 無水乙醇(AR)，-20℃貯存。

11. 70％乙醇，-20℃貯存。

以上試劑1、2、5、6、9均需高壓滅菌，4℃貯存備用。

主要設備

1. 高速冷凍機

2. 恒溫水浴

3. 離心機

4. 電泳儀及電泳槽

實驗材料

人外周血

實驗步驟

1. 取2~5ml外周全血，加9倍體積的預冷溶液Ⅰ，振搖約5~10分鐘至溶液均一透明，于4℃3000×g離心10分鐘。

2. 棄上清液，沉淀加0.9％NaCl適量洗滌3000xg離心10分鐘。

3. 棄上清，加5ml預冷溶液Ⅱ懸浮核沉淀，加SDS至終濃度0.5％和加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，混勻，65℃水浴保溫5小時。

4. 加1/2體積TE(pH8.0)飽和，混勻，旋轉室溫3分鐘，再加1/2體積的氯仿/異戊醇，顛倒塑料管，輕輕充分混勻，于600×g室溫離心3分鐘，溶液分出兩相，用大口塑料吸頭吸取上層液于一潔凈離心管中，反復抽提至界面清潔。

5. 取上層液，再用等體積氯仿/異戊醇抽提1次，600×g室溫離心3分鐘。

6. 取上層水相，加1/3體積的10mol/L NH₄AC和2倍體積的預冷無水乙醇，充分混勻，纖維狀DNA即從溶液中析出。

7. 用大口塑料吸頭吸出絲狀沉淀物，用70％乙醇洗滌1次，抽干，溶于適量1×TE(pH8.0)中，4℃貯存備用。

8. 電泳鑒定(見質粒DNA的限制性酶及電泳分析)。