人毛細血管內皮細胞的分離

樣品

PBS 兩性霉素 慶大霉素

大剪刀 刮刀 燒瓶 鋼篩網 離心管 層流柜

1. 準備下列器械并消毒（高壓滅菌，或者可能的話一次性使用）：

大剪刀（兩把）

刮刀（兩或三把）

胰蛋白酶消化的燒瓶（每 30 g 絞碎樣品一個）

帶接液器的 250-μM 鋼篩網

15-ml 和 50-ml 離心管

2. 分離組織樣品。所有操作在層流柜中進行。

(1) 從腹整形樣品分離

① 解剖樣品，去除任何皮膚、筋膜、肌肉等，只保留脂肪組織。稱重樣品，每 10 g 分裝一份。

② 在無菌盤上，用剪刀將樣品剪碎。

③ 用 60 ml 注射器（不帶針頭）吹吸樣品，反復3次或至樣品充分液化。

④ 取 20 ml 組織放入裝有 20 ml PBS 的 50 ml 離心管，混勻，700 r/min 離心 5 分鐘吸出含血水相，重復操作，直至樣品相對無血。

(2) 從吸脂樣品分離

① 置真空包裝樣品于篩網上，用含 0.5 μg/ml 兩性霉素和 200 IU/ml 慶大霉素，200 μg/ml 鏈霉素的 PBS 反復沖洗。沖洗過程中用刮刀在被沖洗物周圍攪動，輔助沖洗。

② 取 20 ml 組織放入裝有 20 ml PBS 的 50 ml 離心管，混勻，700  r/min 離心 5 分鐘。吸掉含血水相。

3. PBS 溶解 BSA 至終濃度 4.0 mg/ml（PBS/BSA）；過濾除菌。配制膠原酶溶液，PBS/BSA 溶解膠原酶和 DNA 酶，終濃度分別為 4.0 mg/ml 和 0.02 mg/ml，0.2 μM 濾膜過濾除菌。

10 ml 溶液大約可以處理 10 ml 脂肪樣品。

4. 用無菌刮刀把步驟2中剪碎的脂肪組織刮到胰蛋白酶消化的燒瓶中，然后加入膠原酶，每毫升組織加 1 ml。

5. 37℃ 80 r/min 旋動保溫 30 分鐘。

6. 消化的同時，用 PBS 稀釋 PBS/BSA（4.0 mg/ml BSA）至 BSA 終濃度 0.2 mg/ml。

7. 消化樣品倒入 50 ml 離心管（每管約 20 ml）。

8. 吊筒式醫用臺式離心機室溫 1500 r/min 離心 5 分鐘。

9. 液態脂和水相倒入另一 50 ml 離心管。由于細胞沉淀極易被倒掉，最好使用無菌離心管。

10. 細胞重懸于 5 ml PBS（0.2 mg/ml BSA），1500 r/min 離心 5 分鐘，倒掉上清。沉淀懸于 1 ml 含 5% FCS 的 PBS（PBS/FCS）中。