人神經生長因子基因在酵母中的表達研究

神經生長因子（Nerve Growth Factor,NGF)是一種由118個氨基組成的蛋白質，是神經科學領域中最引人注目的課題之一。但是由于NGF3個鏈內二硫鍵影響折疊的原因，用傳統的基因工程方法獲得大量rhNGF有相當的困難。研究發現，將hNGF蛋白在畢赤酵母表達系統中進行外泌表達，克服了rhNGF無天然活性的問題，表達產物分泌于胞外有利于下游的純化。該研究為rhNGF規模生產和臨床應用打下良好基礎，也為同類產品的研發提供了技術平臺，有利于其它難表達基因產品的制備開發。

畢赤酵母Pichia pastoris目前已是僅次于大腸桿菌的最常用蛋白表達系統，廣泛應用于實驗室規模的蛋白質制備、表征以及結構解析等方面，目前已有上千種蛋白在畢赤酵母系統中得到成功地表達。美迪西科研人員建立了成熟的酵母表達純化服務平臺，提供優質的重組蛋白在畢赤酵母和釀酒酵母中的表達與純化服務。

目前NGF在臨床上試用于治療周圍神經損傷、糖尿病性周圍神經病變、化學試劑或藥物引起的神經中毒等神經系統疾病，療效顯著，是迄今唯一可能應用于臨床治療的神經系統蛋白質因子，而且在一些腫瘤中NGF及其受體常有高濃度表達。美國在應用基因工程的方法生產rhNGF方面已取得很大進展，可是他們在臨床適應證的研究上頗費周折。最近，我國SDA批準了鼠源NGF上市，用于治療化學中毒引起的神經疾病；但基因工程方法生產rhNGF還未取得突破。我國有研究者嘗試了將人神經生長因子基因在酵母中的表達。

1、材料和方法

（1）菌株

通過全基因合成得到人神經生長因子（hNGF）的全基因片斷，將該基因片段插入到含有AOX1啟動子和分泌信號肽序列的載體pPIC9K中，構建了重組表達質粒pPIC9K/rhNGF，轉化Pichia pastoris GS115宿主菌。

通過比較轉化子在培養基MM和MD平板上的生長狀況，篩選His+ Mut+表型轉化子，并在2.0 mg/mL G418平板上篩選得到多拷貝轉化子。搖瓶培養，甲醇誘導外源基因表達，表達產物經SDS-PAGE和Western blot分析，結果表明重組蛋白質相對分子質量13.6×103，能與特異性抗體發生免疫反應；雞胚背神經節法測rhNGF活性，結果顯示表達活性可達104 U/mL。

（2）方法

蛋白表達條件的優化根據影響酵母表達的各種關鍵因素，設計了正交試驗選擇表達條件。　工程菌的發酵培養及蛋白表達取液氮保存甘油管菌株，取適量無菌操作涂布于YPD平板上，30℃條件下倒置培養活化24 h。取活化平板上3～5個單菌落，接于BMG搖瓶，30℃，200 r/min搖床培養24h。以0.5％比例轉接入二級BMG培養基，30℃搖床200 r/min培養24 h，當菌密度達1.0～1.3時，以10％比例接于有BMG培養基的發酵罐中，30℃條件下發酵培養，溶氧（dissolved oxggen, DO）控制在30％，pH為6.0，期間流加甘油。甘油消耗完畢，菌密度達到200以上，DO急劇變化時，開始補加甲醇誘導表達，通過甲醇量控制DO在30％～40％，甲醇殘余不超過1％，補充NH3H2O控制pH 5.6～5.8，誘導表達60h。

蛋白的純化將發酵液在低溫條件下離心，發酵上清超濾濃縮后，經C4-Sepharose疏水層析和CM-Sepharose層析純化，即得rhNGF。

　2、結果　　

（1）酵母表達正交試驗結果

　　根據實驗結果，選擇的較佳表達條件是：發酵溫度28～30℃，甲醇誘導濃度為1.0％～0.8％，發酵pH 5.6～5.8，誘導表達60 h后收集發酵液上清。最高外泌表達活性可達104 U/mL。

（2） rhNGF的表達及活性測定結果

取甲醇誘導60h的發酵液，做SDS-PAGE和生物學活性檢查。

　　電泳結果表明，工程菌表達分泌rhNGF量約為每升發酵液50 mg，約占外泌蛋白的50％，活性測定結果表明，分泌蛋白的活性約為每毫升培養液104U。

（3）蛋白純化結果

　　電泳結果顯示，該酵母表達系統表達的rhNGF，經疏水層析和陽離子交換層析純化后，純度可達到95％以上。2步純化后的樣品活性大于105U/mg。

（4）免疫印跡實驗結果

　　將純化后的rhNGF進行Western blot雜交分析，結果與抗NGF抗體呈陽性反應。

由于天然的NGF來源少，不能滿足臨床和科學研究的需要，因此，利用基因重組技術來獲得大量高活性的人NGF蛋白已成為當務之急。Pichia pastoris 酵母表達系統具有高表達率、遺傳穩定、產物可分泌、發酵工藝成熟等許多優點，同時作為真核生物，它能使外源基因正確翻譯和翻譯后加工，其蛋白糖基化的方式接近高等生物，臨床應用更為安全。試驗表明，運用Pichia pastoris 酵母表達系統可以表達NGF蛋白，而且具有較高的表達率，也為進一步的蛋白提純提供了方便條件。