人臍帶靜脈內皮細胞的分離培養與增殖實驗

膠原酶 血清

Cord Buffor 硫酸鏈霉素 生埋鹽水 EDTA-Na 明膠

插管 止血鉗 注射器 手套 絲線 飯盒 勻漿機 離心機 振蕩器 培養瓶 CO孵箱 顯微鏡 超凈工作臺 孔板

一、臍帶內皮細胞的分離

　
1.  臍帶收集

用無菌止血鉗夾閉臍帶兩端，在止血鉗外側剪斷臍帶，放入盛有4 ℃Cord Buffer的飯盒內。臍帶在4 ℃放置不應超過24 小時。

2.  臍帶內皮細胞分離

　　
（1）帶無菌手套，取出臍帶，在止血鉗內側用碘酒和酒精棉球消毒后，用無菌剪刀將兩端臍帶剪除。

（2）在臍帶一端找到靜脈，插入臍帶靜脈插管，用2 根粗絲線扎牢，用Cord Buffer抽吸有的30 ml注射器沖洗靜脈腔，至將臍血洗凈。

（3）趕出靜脈腔內殘余液體，將臍帶另一端用止血鉗夾閉，用10 ml注射器連接針頭，注入37 ℃預熱的0.1 ％膠原酶約6-8 ml，放入37 ℃ Cord Buffer中保溫6-10 min。

（4）吸出靜脈腔內膠原酶所消化的細胞懸液，加入預加有20 ml Cord Buffer的離心管中，沖洗靜脈腔，一并加入離心管中。

（5）離心，1500 rpm，10 min棄上清，用5～7 ml 20 ％FCS，RPMT 1640重懸細胞，轉入培養瓶，放5 ％CO孵箱。

二、牛下丘腦內皮細胞生長因子粗提物的制備

　　　　　　　
1.  取新鮮牛下丘腦，加1.5倍體積的冰生理鹽水用組織勻漿機勻漿，每次0.5 min，共6次。

2.  在4 ℃條件下用震蕩器機械震蕩約1.5 h。

3.  離心，10000 g，40 min，收取上清液。

4.  按0.5 ％加硫酸鏈霉素，4 ℃過夜。

5.  離心，20000 g，40 min，收取上清液。

6.  用紫外分光光度測280 nm，260 nm OD值按公式計算蛋白含量。

　　　　　　　　　　
7.  過濾，分裝，-20 ℃保存備用。 

三、內皮細胞的培養與鑒定

1.  培養瓶包被明膠

培養瓶（25 cm）中加入0.2 ％明膠3 ml，使其鋪滿瓶底，放4 ℃備用。用前棄去明膠溶液。

　
2.  原代培養

將從臍帶靜脈中收集到的內皮細胞移入包被明膠的培養瓶（25 cm），加5～7 ml 20 ％小牛血清199培養基，按終濃度分別為20 μg/ml和100 μg/ml加入內皮細胞生長因子粗提物和肝素。每3～4 天換液1 次。

　
3.  傳代培養

待內皮細胞生長鋪滿瓶底后即可傳代。吸去培養基，用無血清RPMI1640 2 ml洗培養瓶1 次。加入0.1 ％胰酶、0.02 ％EDTA-Na 3 ml，放37 ℃孵箱。待鏡下見大多數細胞卷縮變圓，可加入含血清培養基3 ml，以終止胰酶的消化作用，用彎頭滴管吹打。收取細胞懸液，加入離心管中，離心1500 rpm，10 min。棄上清，以完全培養基重懸細胞，移入培養瓶擴大培養。

　
4.  內皮細胞鑒定

光鏡下內皮細胞為多角形或梭形，可見1～2 個清晰的細胞核。透射電鏡下， 部分內皮細胞中可有特征性的Weible-Palade小體存在。間接免疫熒光染色，內皮細胞為ⅧR∶Ag陽性。

四、牛下丘腦內皮細胞生長因子粗提物活性的測定

　
1.  0.1 ％胰酶0.02 ％EDTA消化收獲內皮細胞，計數，調整細胞數至5×10⁴ /ml。

2.  細胞懸液加入包被明膠的96孔板，每孔100 μl，5×10³個細胞。

3.  放置于5 ％CO孵箱，24 h，待細胞全部貼壁生長。

4.  每孔加待檢樣品100 μl，每個稀釋度設3個復孔，并設培養基陰性對照。

5.  放5 ％CO孵育，48～72 h，待陰性對照與陽性有明顯差別時，加³HTdR，每孔0.5 μci/50 μl。

　　　　　　　　　　　　　　　　
6.  放5 ％CO孵箱，繼續培養12 h。

7.  細胞收集儀收集細胞，檢測Cpm值可計算刺激指數。

1.  嚴格無菌操作，防止在分離、培養和傳代內皮細胞過程中發生污染。

　　
2.  膠原酶消化時所需濃度，時向要進行預試。如膠原酶濃度過高，內皮細胞容易死亡；濃度過低，則細胞收獲量低。

　　
3.  內皮細胞應進行鑒定，以防將成纖維細胞誤認為內皮細胞。