人血清、血漿及相關液體樣本中血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定

實驗概要

本實驗用試劑盒測定了人血清、血漿及相關液體樣本中血清淀粉樣蛋白A(SAA)的含量。

實驗原理

應用雙抗體夾心法測定標本中人血清淀粉樣蛋白A(SAA)水平。用純化的人血清淀粉樣蛋白A(SAA)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入血清淀粉樣蛋白A(SAA)，再與HRP  標記的血清淀粉樣蛋白A(SAA)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP  酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血清淀粉樣蛋白A(SAA)呈正相關。用酶標儀在450nm  波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中人血清淀粉樣蛋白A(SAA)濃度。

主要試劑

1. 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶
2. 酶標試劑 6ml×1 瓶
3. 樣品稀釋液 6ml×1 瓶
4. 顯色劑A 液 6ml×1 瓶
5. 顯色劑B 液 6ml×1/瓶

6. 終止液 6ml×1 瓶

7. 標準品（1600μg/L） 0.5ml×1 瓶

8. x 標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶

主要設備

1. 酶標包被板 12 孔×8 條

2. 說明書 1 份

3. 封板膜 2 張

4. 密封袋 1 個

實驗材料

標本要求
1. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融；
2. 不能檢測含NaN₃ 的樣品，因NaN₃ 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

實驗步驟

1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
800μg/L 5 號標準品 150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液
400μg/L 4 號標準品 150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
200μg/L 3 號標準品 150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
100μg/L 2 號標準品 150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
50μg/L 1 號標準品 150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2.   加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5  倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此
重復5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液后15 分鐘以內進行。
操作程序總結：
計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD  值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD  值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3. 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD 值大于標準品孔第一孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物請避光保存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。
8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用。