免疫共沉淀的方法
| 實驗方法原理 | 完整的細胞經甲醛處理通過蛋白質－DNA 和蛋白質－蛋白質之間的交聯固定體內染色質的結構。抽得細胞總抽提物并進 超聲破碎使染色質溶解并將 DNA 剪切為適當長度的片段。可溶的染色質與感興趣蛋 白質的一抗孵育，蛋白質－抗體復合物可以通過與偶聯到 Sepharose 上的 G 蛋白共孵育而 被沉淀下來，因此與感興趣的特殊蛋白交聯的 DNA 分子就同時被共沉淀下來。通過對抗體復合物膠珠的洗脫，破壞蛋白質－DNA 的交聯并純化 DNA。沉淀得到的 DNA 可用 于使用特定的引物進行 PCR 擴增來鑒定富集的 DNA 序列。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | 甲醛甘氨酸（加熱滅菌）TBS 溶液裂解緩沖液LiCl 去垢劑洗滌劑TE 緩沖液洗脫緩沖液蛋白酶 K 溶液LiCl酚 氯仿 異戊醇乙醇 |
| 儀器、耗材 | 旋蓋管平底微量離心管多孔禍旋混合器26－G 針頭圓底管（17 mm×100 mm）微量離心管超聲儀（探頭式）旋轉混合器水浴和加熱器培養箱或烤箱 |
| 實驗步驟 | 1. 每個實驗樣品需要培養 50 ml 酵母細胞生長至 OD600為 1.0～1.5。事先備好一個 50 ml 旋蓋管加入室溫的 37％ 甲醛溶液 1.4 ml。 2. 在管中加入酵母培養液至 50 ml 刻度以下，為即將加入的 2.5 ml 甘氨酸留出充足的空間。旋緊管蓋，室溫 15 min，偶爾顛倒一下管子以使溶液混合。 3. 在管中加入 2.5 ml 2.5 mol/L 甘氨酸（終濃度至 125 mmol/L） 停止交聯；混合并室溫 5 min。 4. 4℃， 1500 g 離心細胞 5 min， 棄上清。將細胞置冰上，用 20 ml 冰冷的 TBS 重懸。重復此步。 5. 4℃， 1500 g 離心細胞 5 min， 棄上清。用 1 ml 冰冷的 TBS 重懸細胞并轉到冰冷的 2 ml 平底微量離心管中，置冰上。 6. 以最高轉速短暫離心收集細胞，棄上清。 7. 如果細胞凍結了，則在冰上解凍。在細胞沉淀中加入 250 ul 冰冷的含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液。再加入 1 體積的玻璃珠（約 350 ul）。 8. 在多孔渦旋混合器中 4℃ 以最高速渦旋混合 30 min 以裂解細胞。 9. 加入 250 ul 冰冷的含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液，短暫渦旋混合。置冰上。 10. 用吸水紙快速將 2 ml 微量離心管外側的冰和水擦掉。顛倒管子，用燒熱的針頭 （26-G） 在管底穿兩個洞。立即將管子放入在冰上的 14 ml 圓底管中，使微量離心管正好懸掛在較大的管子的管口處。 11. 4℃， 使用翻斗式轉子 1000 g 離心 3 min，將樣品置冰上。確定除玻璃珠外所有的樣品全都進入 14 ml 管中后，棄去盛有玻璃珠的 2 ml 微量離心管。 12. 用 1 ml 的微量加樣器吸取溶液層吹吸幾次重懸沉淀。然后將懸浮液轉移到冰上的 1.5 ml 微量離心管中。 13. 超聲破碎切割染色質使其平均大小為 500 bp：使用超聲破碎儀時，12 s 啟動 3 次 （如 Branson Sonifier250，能量設置 2.0，100％ 作用循環）。在每次啟動之間將樣品在冰上放置至少 2 min。 14. 4℃ 以最高轉速離心 5 min， 沉淀為未破碎的細胞和細胞碎片。將上清轉移到一個新的在冰上的 1.5 ml 微量離心管中。 15. 4℃ 以最高轉速離心 15 min，將上清轉移到一個新的在冰上的 1.5 ml 微量離心管中。 16. 在染色質抽提物中加入感興趣的蛋白質一抗并混勻。4℃ 溫育 1 h 至過夜。 17. 使用寬口移液頭（如將前端剪掉的 200 ul 移液頭），每個樣品加入 30 ul G 蛋白－Sepharose 膠珠（在 PBS 的 50％ 懸浮液）并混勻。4℃ 旋轉混合 1 h。 18. 室溫，1000 g 離心 1 min， 取 1/10 體積（50 ul） 上清至新的 1.5 ml 微量離心管中。加入 200 ul TE/1％SDS，混勻放置于 4℃ 直到步驟 27。 19. 棄去剩余的上清。加入 1 ml 裂解緩沖液在旋轉混合器上室溫孵育 5 min，洗滌膠珠。室溫 1000 g 離心 1 min 沉淀膠珠。 20. 加入 1 ml 裂解緩沖液重復步驟 19。 21. 加入 1 ml 裂解緩沖液 500 重復步驟 19。 22. 加入 1 ml LiCl/去垢劑溶液重復步驟 19。 23. 加入 1 ml TE 緩沖液重復步驟 19。離心后，在不影響膠珠的情況下盡量去盡洗滌溶液。 24. 加入 100 ul 洗脫緩沖液，混勻。65℃ 水浴或加熱器 10 min 以從抗體膠珠上洗脫沉淀物。 25. 以最高速短暫離心膠珠，將洗脫液（100 ul） 轉移到新的 1.5 ml 微量離心管中。 26. 在膠珠的管中加入 150 ul TE/0.67％ SDS，顛倒離心管幾次，以最高速短暫離心。將第二次洗脫液（150 ul） 與第一次的（沉淀物）合并。 27. 沉淀和總混合物（步驟 18） 在 65℃ 空氣培養箱或烤箱中溫育至少 6 h。 28. 加入 250 ul 蛋白酶 K 溶液，對于沉淀物，37℃ 溫育 30 min； 對于總混合物，37℃ 溫育 2 h。 29. 加入 55 ul 4 mol/L LiCl 和 500 ul 25：24：1 酚/氯仿/異戊醇，劇烈渦旋振蕩 1 min （使用多孔渦旋混合器將很方便），室溫以最高轉速離心分層（沉淀 5 min； 總混合物 10 min）。 總混合物通常需要進行第二次酚/氯仿/異戊醇抽提。 30. 將上層水相轉移到新的 1.5 ml 微量離心管中，加入 1 ml 100％ 乙醇。充分混合， 室溫以最高轉速離心 15 min 沉淀 DNA。棄上清。 沉淀管中離心后得到的沉淀顆粒非常小，幾乎觀察不到；而總混合物中有大量的白色沉淀。 31. 沉淀用 750 ul 75％ 乙醇清洗，室溫以最高轉速離心大于 5 min，棄上清。樣品在空氣中干燥約 10 min。 32. 用 100 ul TE 重懸來自于沉淀管的沉淀。儲存于 －20℃。 33. 用 50 ul 含有 0.2 mg/ml RNase A （由 20 mg/ml 的儲液稀釋）的 TE 重懸來自于總混合物管的沉淀，37℃ 溫育 30 min。再加入 950 ul TE 并儲存于 －20℃。 34. 建立 50 ul PCR 反應，引物濃度為 1 pmol/ul，使用 2 ul 沉淀或 1 ul 總混合物作為模板。 35. 使用以下熱循環參數進行熱啟動 PCR： 36. 在 PCR 產物中加入適當的上樣緩沖液，使用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳通過溴化乙錠染色進行分析。 |
