低溫掃描電子顯微術是20世紀80年代迅速發展和廣泛應用的方法。它包括生物樣品的冷凍固定、冷凍干燥、冷凍割斷和冷凍含水樣品的掃描電子顯微術等。
冷凍固定
將生物材料投入低溫的致冷劑中，如液氦、液氮、液體氟利昂及丙烷等。快速冷凍可使生物組織細胞的結構和化學組成接近于生活狀態。被冷凍固定的生物樣品，可以在低溫條件下轉移到具有低溫樣品臺的掃描電子顯微鏡中直接觀察無需進一步處理或僅在冷凍樣品表面噴鍍一薄層金屬。這種方法不僅快速簡便，而且可以排除由于干燥法造成收縮的假象，特別適合于研究含水量很高的生物材料。
冷凍干燥
生物樣品經冷凍固定后，其中的水分凍結成冰，表面張力消失；再將冷凍樣品放于真空中，使冰漸漸升華為水蒸氣。這樣獲得的干燥樣品在一定程度上避免了表面張力造成的形態改變。由于水冷凍而形成的冰晶會破壞組織結構，冰在真空中升華速度很慢，同時需要大型復雜的冷凍干燥裝置，所以冷凍干燥法沒有臨界干燥法應用廣泛。如果在冷凍前用有機溶劑置換樣品中的水，而后，冷凍干燥，則可消除冰晶對結構的破壞，并大大縮短干燥時間；也無需特殊裝置。
冷凍隔斷
為了觀察臟器或細胞內部結構，可切斷冷凍樣品，再經化學固定、導電染色、脫水和臨界點干燥及噴鍍金屬，用掃描電鏡觀察割斷表面暴露出的內部結構。冷凍割斷又包括乙醇割斷法、二甲基亞砜割斷法及冷凍斷裂法等多種。用冷凍割斷法可獲得高分辨的組織細胞內部三維構造的掃描電子顯微鏡圖象。