體外DNA重組技術3

【實驗試劑與器材】

（1）Oligo(dT)纖維素

（2）層析柱裝置

（3）1×上樣緩沖液：20mM Tris.Cl (pH7.6)，0.5M NaCl，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.1%十二烷基肌氨酸鈉(SLS)

配制方法: 用Tris.HCl、NaCl和EDTA母液，加入各成分確切含量后，15磅高壓15分鐘，待溶液冷卻至65℃時，加入預先在65℃水浴30min的 10% SLS，至終濃度為0.1%。也可用0.05M檸檬酸鈉代替Tris.HCl。然后用0.1%DEPC處理整個緩沖液。

（4）洗脫緩沖液: 10 mM Tris.HCl (pH7.6)，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.05% SDS

先將Tris.HCl和EDTA混合后高壓，然后加10%SDS至所需濃度，此緩沖液配制后不可高壓。

（5）3M NaAc (pH5.2)

（6）DEPC (焦碳酸二乙酯,sodium acid pyrophophate)處理水：0.1% DEPC雙蒸水，37℃搖動溫育至少12h，然后15磅高壓15min。

【實驗方法與步驟】

（1）將0.5～1g的Oligo(dT)纖維素懸于0.1M NaCl溶液中，然后用0.5~1ml裝柱；用3倍柱容積的DEPC-H2O洗柱，再用1×上樣緩沖液洗柱，至洗出液pH<8.0；

（2）將RNA溶液在65℃加熱5min，然后迅速冷卻至室溫，加入等體積的2× 上樣緩沖液，混合后直接上樣，并收集流出液。重復此過程2-3次以使mRNA更充分地結合到纖維素上；

（3）用2～3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫mRNA；

（4）加入1/10容積的3M NaAc (pH5.2)于mRNA洗脫液中，混合后加入2.5倍體積的冰冷無水乙醇，混勻后-20℃沉淀30min；

（5）10000×g，4℃離心15min，棄上清。用70%乙醇漂洗，10000×g離心5min，棄上清,室溫蒸發乙醇；

（6）用適量的無RNase污染的水溶解mRNA。此mRNA可用于 Northern印跡，RT-PCR及核酸保護試驗。若長期保存，可加入3倍體積的無水乙醇，置-70℃。

【注意事項】

（1）因為RNA易被RNase降解；整個操作不能有RNase的污染，同時要注意無菌操作。

（2）所有試劑的配制均用DEPC處理過的水

（3）加入3倍體積的100%乙醇于RNA溶液中，-70℃可長期保存.

（4）此RNA可用于第一股cDNA的合成，Northern印跡，核酸酶保護試驗等。

三、質粒DNA的制備

【實驗目的】

熟悉質粒DNA常用的制備方法
【實驗原理】

轉化細胞中的質粒DNA制備主要包括三個步驟：細菌的培養、收獲和裂解、質粒的分離和純化。低濃度的堿和SDS可以有效地裂解細菌的細胞壁，從而使質粒釋放出來。

【實驗試劑與器材】

1.細胞懸浮液: 50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl,（ pH8.0），10mM EDTA.Na2,（pH8.0）

2.細菌裂解液: 0.2mol/L NaOH，1% SDS

3.中和液: 60ml 5M醋酸鉀，11.5ml 冰醋酸，28.5ml雙蒸水

4.3mol/L NaAc (pH 5.2)

5.TE飽和酚 (pH8.0)

6.氯仿/異戊醇 = 24:1

7.RNase（20mg/ml）

【實驗方法與步驟】

（一）質粒的小量制備:

1.將5ml LB培養液(含篩選抗生素)加入到容量為15ml并通氣良好的試管中，然后將轉化菌的一個單菌落接種于培養液中，37℃以225rpm速度振蕩培養 14-16h；

2.10,000rpm，4℃離心5min，棄培養液；

3.用預冷的細胞懸浮液將菌體懸浮起來，室溫放置5min；

4.加入細菌裂解液，上下顛倒微量離心管以裂解細菌，待溶液變黏稠為止；

5.加入中和液，上下顛倒混合后置冰上5min，12,000rpm，4℃離心5min；

6.將上清移至另一離心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等體積的TE飽和酚/ 氯仿(1:1)混合液，振蕩混勻1min，12,000rpm離心2min；

7.將上層水相移至另一離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)溶液，振蕩混勻1min，12,000rpm離心2min；

8.將上層水相移至另一離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，置-20℃沉淀15-30min，然后12,000 rpm離心15min；

9.棄上清，于沉淀中加入100?滋L雙蒸水或TE(pH8.0)溶解沉淀，加入20?滋g/ml RNase，置室溫30min，然后加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，振蕩混勻1min，12,000rpm離心2min，將上層水相移至另一離心管中，加入0.1倍體積3M NaAc(pH5.2)和2.5倍體積無水乙醇，置-20℃沉淀15~30min，然后離心15min；

10.棄上清，加入70%乙醇( 注意不要混合)，12000rpm離心10min；

11.棄上清，真空干燥或自然干燥質粒DNA；

12.用去離子水溶解質粒DNA，-20℃保存備用。