使用TAQMAN分析法的高通量基因分型實驗

基因組DNA

PCR 混合液

96孔透明板和蓋子水平離心機ABI PRISM 7700 測序系統熱循環儀統計軟件包

1.96孔透明板B到H行每孔加2ul (30ng）基因組DNA，保留A行作對照—其中4孔只加2ul緩沖液作為「無 DNA」對照，余下8孔每孔加24基因組DNA作為陽性對照，兩種純合子各加4孔。

2.每孔加23ul PCR混合液，蓋上透明蓋，在水平離心機上短暫離心，用ABI PRISM 7700測序儀得到一個PCR反應前熒光讀數。使用「PlateRead」形式，確保選中Use Spectral Compensation forEndpoint 項（在Advanced Optionsinthe Instrument and Diagnostics菜單下）。

3.用下面的條件在熱循環儀上開始PCR。

1個循環：2 min 50°C

1個循環：10min 95°C(變性）

40個循環：15s 94°C(變性)

1 min 62°C(復性/延伸)

最終步驟：無限4°C(維持）

4.再次讀取熒光得到一個PCR反應后讀數。如果使用ABI PRISM 7700提供的等位基因分析（allele-calling)軟件，選用「AUelicDiscrimination」模式讀取焚光，通過算法可以自動分出基因型或通過視覺檢查進行基因分型。

如果進行大規模基因分型（如樣本數>500)，將多個孔板的樣本數據集中起來確定基因型顯得更為準確。這樣，請遵照本方案中的剩余步驟。

5.將原始數據（含 PCR 前和 PCR 后的）從孔板讀數形式導入統計軟件包。用如下方式計算標準化的熒光值：（報道熒光值一背景）/(參照熒光值一背景）；報道熒光在 FAM 和 VIC 道，參照熒光在 ROX 道。

6.用一種非參數的測試（如 Kruskal-WaUis 測試）比較孔板之間每一種報道染料的平均 PCRhli 標準滅光。如果一塊孔板（或一組孔板）的 pcR 前突光顯著的不同于其他孔板，則相應的調整 PCR 后熒光值。例如，某一特定孔板的 FAM 報道染料的平均熒光是其他孔板的 1.5 倍，則該板每一孔的 PCR 后 FAM 熒光值除以該因數。

7.使用逐步聚類分析（K-meansclustering) 自動將已校正的 PCR 后數據分成 4 組—3 個基因型和 1個「無DNA」對照。大多數統計軟件包提供了可以直接使用的聚類分析算法。

通常，聚類是明顯的而無需進一步處理。為確定基因型分配是否有意義，檢查數據的散點圖很重要。例如，極端值會破壞聚類分析算法而產生明顯錯誤的分類結果。去除這種極端值通常就有正確的分類結果。