克隆基因的表達（expressionofclonedgene）2

在雙鏈 DNA 分子中，只有一條鏈轉錄成 mRNA，這條鏈稱為有意義鏈(sense strand)，該基因的另一條鏈則稱反意義鏈(antisense strand)。在含有許多基因的 DNA 雙鏈中，每個基因的有意義鏈并不是在同一條 DNA 鏈上。也就是說，一條鏈上既具有某些基因的有意義鏈，也含有另外一些基因的反意義鏈。由于 mRNA 聚合酶是沿著 DNA 鏈的 3’→5’方向移動，DNA 鏈與合成的 RNA鏈有反平行關系，所以 mRNA 鏈的合成方向是 5’→3’，mRNA 上的信息的閱讀是從多核苷酸鏈 5'末端向 3’末端進行。從轉錄和翻譯的方向也可看出，在原核生物細胞內當 mRNA的合成還沒有完成時，蛋白質或多膚的翻譯就己經開始了。

④原核基因一般不含有內含子(intron)，在原核細胞中缺乏真核細胞的轉錄后加工系統。因此當克隆的含有內含子的真核基因在原核細胞中轉錄成 mRNA 前體后，其中內含子部分不能被切除。

⑤原核生物基因的控制主要在轉錄水平，這種控制要比對基因產物的直接控制要慢。對RNA 合成的控制有兩種方式，一是起始控制(啟動子控制)，二是終止控制(衰減子控制)。

⑥在大腸桿菌mRNA的核糖體結合位點上，含有一個轉譯起始密碼子及同16S核糖體RNA 3'末端堿基互補的序列，即 SD 序列，而真核基因則缺乏此序列。

從上述特點可以看到，欲將外源基因在真核細胞中表達，必須考慮表達載體、外源基因的性質、原核細胞的啟動子和 SD 序列、閱讀框架及宿主菌調控系統等基本條件，也就是說必須滿足以下條件：⑴通過表達載體將外源基因導入宿主菌，并指導宿主菌的酶系統合成外源蛋白；⑵外源基因不能帶有間隔順序(內含子)，因而必須用 cDNA 或全化學合成基因，而不能用基因組 DNA(genomic DNA)；⑶必須利用原核細胞的強啟動子和 SD序列等調控元件控制外源基因的表達；⑷外源基因與表達載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架(open reading frame)；⑸利用宿主細胞的調控系統，調節外源基因的表達，防止外源基因的表達對宿主菌的毒害。

2 原核生物作為受體細胞具備的特點

外源基因表達系統泛指目的基因與表達載體重組后，導入合適的受體細胞，并能在其中

有效表達，產生目的基因產物(目的蛋白)。由此可知，外源基因表達系統由基因表達載體和相應的受體細胞兩部分組成。基因表達系統有原核生物基因表達系統和真核生物基因表達系統。

目前應用最廣泛的是原核生物基因表達系統，如大腸桿菌表達系統、芽胞桿菌表達系統等。原核生物作為基因表達系統的受體細胞具有如下的特點：

①原核生物大多數為單細胞異養，生長快，代謝易于控制，可通過發酵迅速獲得大量基因表達產物。

②基因組結構簡單，便于基因操作和分析。

③多數原核生物細胞內含有質粒或噬菌體，便于構建相應的表達載體。

④生理代謝途徑及基因表達調控機制比較清楚。

⑤不具備真核生物的蛋白質加工系統，表達產物無特定的空間構象。

⑥內源蛋白酶會降解表達的外源蛋白，造成表達產物的不穩定性。

近年來，真核生物基因表達系統發展很快，真核生物如酵母菌、植物細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等也被廣泛用作基因表達系統的受體細胞，并構建了一系列相應的表達載體。要使外源基因在細胞中高效表達，構建的表達載體必須具備基因表達的基本條件，這些條件包括外源基因在細胞中的拷貝數、基因轉錄的水平、mRNA 翻譯的速率等。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性細胞，其遺傳背景清楚，目標基因表達的水平高，培養周期短，目前大多數外源基因都是以大腸桿菌為受體系統進行表達的，它是目前為止應用最廣泛的基因。

3 在大腸桿菌中高效表達目的基因的策略

大腸桿菌表達系統是目前應用最廣泛的表達系統，由于待表達的外源基因結構具有多樣性，尤其是真核生物基因的結構與大腸桿菌基因結構之間存在較大的差異，因而在構建表達系統時必須具體情況具體分析。一般來說，高效表達外源基因必須考慮以下基本原則：
①優化表達載體的設計。為了提高外源基因的表達效率，在構建表達載體時對決定轉錄起始的啟動子和決定 mRNA 翻譯的SD序列進行優化。具體方法包括組合強啟動子和強終止子；增加 SD 序列中與核糖體 16S rRNA 互補配對的堿基因序列，使 SD 序列中6～8 個堿基與核糖體16S rRNA 的堿基完全配對；根據待表達外源基因的不同情況調整 SD 序列與起始密碼子 ATG 之間的距離及堿基的種類；防止核糖體結合位點附近序列轉錄后形成“莖環”二級結構。

②提高稀有密碼子 tRNA 的表達作用。多數密碼子具有簡并性，而不同基因使用密碼子的

頻率不相同。大腸桿菌基因對某些密碼子的使用表現了較大的偏愛性，在幾個同義密碼中往往只有一個或兩個被頻繁地使用。如編碼 Pro 的密碼子包括 CCG、CCC、CCU 和CCA 等，而其中的表達系統。第一個密碼子在大腸桿菌的基因中都高頻地出現，而另外三個密碼子出現的頻率很低。同義密碼子使用的頻率與細胞內相應的 tRNA 的豐度呈正相關，稀有密碼子的 tRNA在細胞內的豐度很低。在 mRNA的翻譯過程中，往往會由于外源基因中含有過多的稀有密碼子而使細胞內稀有密碼子的 tRNA供不應求，最終使翻譯過程終止或發生移碼突變。此時可通過點突變等方法將外源基因中的稀有密碼子轉換為在受體細胞中高頻出現的同義密碼子。

③提高外源基因 mRNA 的穩定性。大腸桿菌的核酸酶系統能專一性地識別外源 DNA或 RNA并對其進行降解。對于 mRNA 來說，為了保持其在宿主細胞內的穩定性，可采取兩種措施，一是盡可能減少核酸外切酶可能對外源基因 mRNA的降解，二是改變外源基因 mRNA 的結構，使之不易被降解。

④提高外源基因表達產物的穩定性。大腸桿菌中含有多種蛋白水解酶，在外源基因表達

產物的誘導下，蛋白水解酶的活性可能會增加。因此，須采用多種措施提高外源蛋白在大腸桿菌細胞內的穩定性。常用的方法包括：將外源基因的表達產物轉運到細胞周質或培養基中；選用某些蛋白水解酶缺陷株作為受體菌；對外源蛋白中水解酶敏感的序列進行修飾或改造；在表達外源蛋白的同時，表達外源蛋白的穩定因子。

⑤優化發酵過程。由于細菌在 100L 以上的發酵罐中的生長代謝活動與實驗室條件下

200mL 搖瓶中的生長代謝活動存在很大差異，在進行工業化生產時，工程菌株大規模培養的優化設計和控制對外源基因的高效表達至關重要。優化發酵過程既包括工藝方面的因素也包括生物學方面的因素。工藝方面的因素如選擇合適的發酵系統或生物反應器，目前應用較多的有罐式攪拌反應器、鼓泡反應器和氣升式反應器等。生物學方面的因素包括多方面，首先是與細菌生長密切相關的條件或因素，如發酵系統中的溶氧、pH 值、溫度和培養基的成分等，這些條件的改變都會影響細菌的生長及基因表達產物的穩定性。生物因素的第二方面是對外源基因表達條件的優化。在發酵罐內工程菌生長到一定的階段后，開始誘導外源基因的表達，誘導的方式包括添加特異性誘導物和改變培養溫度等。使外源基因在特異的時空進行表達不僅有利于細胞的生長代謝，而且能提高表達產物的產率。生物因素的第三方面是提高外源基因表達產物的總量。外源基因表達產物的總量取決于外源基因表達水平和菌體濃度。在保持單個細胞基因表達水平不變的前提下，提高菌體密度可望提高外源蛋白質合成的總量。

第三節 外源基因在真核細胞中的表達系統

1. 真核生物表達的優越性和必要性

① 真核生物具有轉錄后加工系統，可識別并刪除基因中的內含子，剪切加工為成熟mRNA.

②具備完善的翻譯后加工系統，可進行糖基化、乙酰化等修飾，使蛋白形成正確的天然構型，因而真核生物表達系統產生的蛋白更接近天然狀態，有利于其功能、生物活性的研究。

③某些真核細胞可將基因表達產物分泌到細胞培養液中，簡化了純化工藝，降低了生產成本。

另外，由于真核生物表達的調控方式非常復雜，有助于我們深入了解基因調控的機制。

2. 真核基因組的復雜性
與原核生物比較，真核生物的基因組更為復雜，可列舉如下。

（1）真核基因組比原核基因組大得多，大腸桿菌基因組約4×106bp，哺乳類基因組在109bp數量級，比細菌大千倍；大腸桿菌約有4000個基因，人則約有10萬個基因。

（2）真核生物主要的遺傳物質與組蛋白等構成染色質，被包裹在核膜內，核外還有遺傳成分(如線粒體DNA等)，這就增加了基因表達調控的層次和復雜性。