免疫染色法檢定蛋白質

實驗概要

轉印到紙上的蛋白質抗原，可與其專一性抗體結合，再以二次抗體-酶結合體(2nd Ab-HRP) 或Protein A-HRP 呈色；可在一群轉印色帶中，專一性地挑出目標蛋白質，是最有用的檢定工具。

主要試劑

1. 抗體溶液：可用傳統抗血清或單株抗體，其最適使用濃度，隨抗體效價不同而異，以下為一般適用范圍的參考，均以明膠-NET 稀釋的。

   1) 傳統抗血清：1:100 到1:1，000

   2) IgG (冷凍干燥品)：10~50 μg/mL

   3) 單株抗體 (小白鼠腹水) ：1:200到1:5，000

   4) 單株抗體 (細胞培養液)：原液或1:10明膠-NET：用來稀釋抗體溶液或酶聯體明膠gelatin (Merck 4070，0.25%) 5.0 gm；NaCl (0.15 M) 17.5 gm；EDTA (5 mM) 3.6 gm；Tween-20 (0.05%) 1.0 mL；Tris (Tris base，50 mM) 12.1 gm加熱溶解于1800 mL 純水后pH 調到8.0，再加水到 2000 mL。

2. 酶聯體：

可使用2nd Ab-HRP 或Protein A-HRP，使用濃度每家商品不同，約為1:1000到1:5000 的間，以明膠-NET 稀釋的。

3. PBST 洗液

4. DAB 基質溶液：DAB (diaminobenzidine，Sigma D-5637) 5 mg溶于100 mL Buffer A-0，再加10 μL H₂O₂，新鮮配制，避光貯存。 DAB為致癌物質，稱量時勿吸入DAB 細塵，并小心處理秤量紙。

實驗步驟

1. 尿素洗過夜的轉印紙再以10 mL PBST 洗三次，每次約10 min，均在上述方形培養皿中進行。

2. 轉印紙放在明膠NET 溶液中反應，置室溫中反應1h。一般使用方形培養皿當容器，但亦可裝入塑料袋中反應，較節省試劑用量。

3. 反應后，以PBST 浸洗二次。

4. 把轉印紙放在抗體溶液中反應，置室溫反應1h。

5. 反應后以PBST 洗三次，改用酶聯體反應，在室溫下反應1h。

6. 以PBST洗四至五次，注意容器也要洗干凈。

7. 加入DAB 基質溶液約10 mL 呈色，盡量避光，并且不時搖動呈色液。

8. 數分鐘內可呈色，在背景加深前倒去DAB，以水沖過數次后晾干。